HPV E6/E7mRNA檢測在宮頸錐切術后隨訪中的應用價值

李亞平　郎凱楠　賈東珂　劉玉玲

【摘要】 目的：探討人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）E6/E7mRNA檢測用于宮頸錐切術后隨訪的應用價值。方法：對因高級別宮頸上皮內瘤變行宮頸錐切術、隨訪資料完整的216例患者進行隨訪，所有患者均于術后3、9、12、18個月進行HPV-DNA、E6/E7mRNA檢測及液基細胞學檢查，若細胞學≥ASCUS或HPV-DNA陽性或E6/E7mRNA陽性者均應行陰道鏡檢查并行宮頸活檢術，若活檢病理提示宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）則定義為復發，并終止繼續隨訪。結果：隨訪18個月，累計復發23例，復發率為10.6%（23/216）。HPV E6/E7mRNA和HPV-DNA診斷宮頸錐切術后病變復發的ROC曲線下面積分別為0.899[95%CI（0.810，0.987）]、0.872[95%CI（0.801，0.943）]。HPV-DNA與HPV E6/E7mRNA兩種檢測方法預測錐切術后病變復發的敏感度及陰性預測值比較，差異均無統計學意義（P>0.05），但HPV E6/E7mRNA檢測預測錐切術后病變復發的特異度及陽性預測值均高于HPV-DNA檢測，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：HPV E6/E7mRNA檢測在宮頸錐切術后隨訪中具有一定的應用價值，可降低HPV一過性感染檢出率，提高高級別上內病變的檢出率，可有效指導進一步陰道鏡檢查，避免過渡轉診陰道鏡。

【關鍵詞】 HPV-DNA; E6/E7mRNA; 宮頸錐切術; 隨訪

【Abstract】 Objective：To explore the application value of HPV E6/E7mRNA detection for follow-up after cervical conization.Method：216 patients who have undergone cervical conization due to high-grade cervical intraepithelial neoplasia and have complete follow-up data were followed up.All patients were tested for HPV-DNA and E6/E7mRNA and liquid-based cytology at 3，9，12，and 18 months after surgery.If the cytology was≥ASCUS or HPV-DNA was positive，thus colposcope and cervical biopsy should be operated.If biopsy pathology indicates CIN was defined as recurrence，and stopped continuing follow-up.Result：After 18 months of follow-up，23 patients had a cumulative recurrence，with a recurrence rate of 10.6%（23/216）.The area under the ROC curve of HPV E6/E7mRNA and HPV-DNA in diagnosing the recurrence of cervical conus resection was 0.899[95%CI（0.810，0.987）]，0.872[95%CI（0.801，0.943）]respectively.The sensitivity and negative predictive value of HPV-DNA and HPV E6/E7mRNA to predict the recurrence of lesions after conical resection were compared，the difference was not statistically significant（P>0.05）.However，the specificity and positive predictive value of HPV E6/E7mRNA detection in predicting the recurrence of lesions after cone resection were higher than that of HPV-DNA detection，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：HPV E6/E7mRNA detection has certain application value in the follow-up after cervical conical resection，which can reduce the detection rate of HPV transient infection，improve the detection rate of high-grade internal lesions，and effectively guide further colposcopy to avoid the transition to colposcopy.

【Key words】 HPV-DNA; E6/E7mRNA; Cervical conization; Follow up

First-authors address：The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.02.032

宮頸環形電切術（loop electrosurgical excision procedure，LEEP）和冷刀錐切術（cold knife conization，CKC）是臨床上治療宮頸高級別上皮內瘤變的常用治療手段，其可在保留子宮的同時切除病變的宮頸組織，但術后仍存在病變復發的可能[1]。因此如何在術后的長期隨訪中及時發現病變復發并尋找一種可靠、準確的隨訪方案是臨床醫生面臨的重要難題。近年來，HPV E6/E7mRNA檢測作為新型的檢測方法，在預測宮頸病變復發或進展有較大價值[2]。本研究通過與HPV-DNA檢測進行比較，探討HPV E6/E7mRNA檢測在宮頸錐切術后隨訪的應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2015年6月-2016年9月在鄭州大學第二附屬醫院婦科因宮頸高級別上皮內瘤變行宮頸錐切術、隨訪資料完整的患者216例為研究對象進行臨床資料回顧性分析?；颊吣挲g24～65歲，中位年齡42歲，隨訪時間9～18個月，復發例數23例，復發率為10.6%。納入標準：（1）術前、術后均經本院病理科證實為CIN2或CIN3，術后無病理升級為浸潤癌;（2）術后病理提示切緣均為陰性;（3）臨床資料完整;（4）既往無宮頸手術史;（5）宮頸錐切術在本院進行;（6）簽署知情同意書，同意自愿參與本研究。排除標準：（1）妊娠女性;（2）合并其他部位惡性腫瘤患者;（3）陰道局部使用抗病毒藥物;（4）子宮切除術后;（5）陰道及宮頸急性炎癥;（6）24 h內有陰道灌洗上藥。

1.2 手術方法 LEEP術在門診局麻下進行，冷刀錐切術在手術室全麻下進行，術前常規行白帶常規檢查排除陰道急性炎癥，完善心電圖、血常規、凝血功能、傳染病等相關檢查，告知患者手術可能出現的風險及并發癥并簽署手術知情同意書。

1.3 隨訪 所有患者均于術后3、9、12、18個月進行HPV-DNA、E6/E7mRNA檢測及液基細胞學檢查，若細胞學≥ASCUS或HPV-DNA陽性或E6/E7mRNA陽性者均應行陰道鏡檢查并行宮頸活檢術，若活檢病理提示宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）則定義為復發，并終止繼續隨訪。

1.3.1 細胞學檢查 取材前24 h內無陰道沖洗、放藥及性生活，采用新柏氏薄層液基細胞學技術（thinprepcytotogic tes，TCT）對宮頸脫落細胞進行檢測。采用TBS（the bethesda system）報告系統進行結果判讀。（1）未見上皮內病變細胞或惡性細胞（NILM）：包括正常范圍和良性反應性細胞改變（輕、中、重度炎癥反應）。（2）鱗狀上皮內病變包括：①未明確診斷意義的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cell of undetermined signification，ASCUS）和不除外高級別上皮內病變的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cell cannot exclude HSIL，ASC-H）;②低級別鱗狀上皮內病變（low grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）;③高級別鱗狀上皮內病變（high grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）;④鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）。（3）腺細胞病變包括：①不典型腺細胞（atypical glandularcell，AGC）;②傾向于瘤變的不典型腺細胞;③宮頸管原位腺癌;④腺癌。

1.3.2 HPV-DNA檢測 采用凱杰生物公司提供的宮頸取樣器進行宮頸管取樣，將取樣器置于宮頸口順時針旋轉5圈，應用第二代捕獲雜交技術（HC-Ⅱ），可檢測出13種高危型HPV病毒（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型），其正常負荷量范圍為0～1 pg/mL，若超過1 pg/mL則為陽性。

1.3.3 HPV E6/E7mRNA檢測 采用由豪洛斯公司提供的AptimaTM HPV檢測試劑及取樣器進行宮頸取樣，將取樣器置于宮頸后順時針旋轉5圈。可檢測出高危型HPV E6/E7mRNA的表達，拷貝數≥1 copies/mL為陽性。

1.3.4 陰道鏡及活組織病理檢查 細胞學≥ASCUS或者高危型HPV陽性或者HPV E6/E7mRNA陽性者需轉診陰道鏡。陰道鏡檢查前需24 h內無陰道藥物放置及陰道沖洗且需排除陰道炎癥，由本院專門陰道鏡醫生使用電子陰道鏡，通過醋酸試驗及碘試驗進行宮頸多點活檢，若陰道鏡檢查不滿意，則同時行宮頸管搔刮術，病理報告方式為：慢性宮頸炎、鱗狀上皮內低級別病變（CIN1）、鱗狀上皮內高級別病變（CIN2）、鱗狀上皮內高級別病變（CIN3）、宮頸鱗狀細胞癌。若病理提示CIN則定義為復發，并終止隨訪。

1.4 統計學處理 應用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理，計數資料采用率（%）表示，單因素分析采用字2檢驗，診斷價值采用受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行宮頸錐切術患者的基本情況 年齡≥45歲和年齡<45歲患者的病變復發率分別為11.4%（14/123）和9.7%（9/93），兩者比較差異無統計學意義（P>0.05）;患者病變級別CIN2和CIN3的復發率比較，差異無統計學意義（P>0.05）;術后病理累及腺體和未累及腺的復發率比較，差異無統計學意義（P>0.05）;手術方式LEEP和CKC的復發率比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 錐切術后隨訪及病變復發情況 術后隨訪18個月，HPV-DNA檢測陽性者累計80例，復發者中陽性20例;HPV E6/E7mRNA陽性者累計46例，其中復發者中陽性19例。其中術后3個月隨訪時未發現病變復發者，術后9個月隨訪復發者5例，術后12個月復發10例，術后18個月復發8例，共隨訪18個月累及復發23例，其中CIN1者7例，CIN2者8例，CIN3者8例，復發率為10.6%（23/216）。術后3、9、12、18個月HPV陽性率分別為25.9%（56/216）、19.9%（43/216）、15.2%（32/211）、12.9%（26/201）。見表2。

2.3 HPV-DNA檢測與HPV E6/E7mRNA檢測的診斷價值 術后隨訪18個月，病變復發者23例，其中CIN1者7例，CIN2者8例，CIN3者8例。由圖1可見，HPV E6/E7mRNA和HPV-DNA診斷宮頸錐切術后病變復發的ROC曲線下面積分別為0.899[95%CI（0.810，0.987）]、0.872[95%CI（0.801，0.943）]。HPV-DNA診斷的臨界值為46.685，以HPV-DNA拷貝量≥46.685為預測界值，其預測錐切術后病變復發的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為88.40%、51.35%、24.00%、96.45%。HPV E6/E7mRNA診斷的臨界值為6.670，以HPV E6/E7mRNA負荷量≥6.670為預測界值，其預測錐切術后病變復發的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為92.01%、74.19%、51.22%、98.86%。兩種檢測方法預測錐切術后病變復發的敏感度及陰性預測值比較，差異均無統計學意義（P>0.05），但HPV E6/E7mRNA檢測預測錐切術后病變復發的特異度及陽性預測值均高于HPV-DNA檢測，差異均有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

3.1 錐切術后病變復發的相關高危因素 近年來，宮頸癌發病率逐年增高，且年輕化越來越明顯[3]。LEEP和冷刀錐切是宮頸錐切最常用的術式，LEEP手術對患者創傷較小，出血較少，對妊娠結局影響較小，但可影響病理醫生對切緣狀態的評估;而冷刀錐切術不僅切除病變較徹底，還可充分評估切緣狀態。雖然宮頸錐切術對高級別上皮內病變有較好的療效，但術后病變復發仍然是急需關注的問題[4]。本研究隨訪共18個月，術后3、9、12、18個月HPV陽性率分別為25.9%（56/216）、19.9%（43/216）、15.2%（32/211）、12.9%（26/201）。有研究表明，錐切術后仍有5%～30%的復發率[5]。本研究隨訪18個月累計復發23例，復發率為10.6%（23/216），與Leguevaque等[6]研究相似。據文獻[7]報道，宮頸錐切術后病變復發的相關危險因素有年齡、病變級別、切緣陽性、病毒負荷量等。Lu等[8]的研究表明年齡>50歲患者病變復發的風險高于年齡≤50歲者，年齡增大是病變復發的危險因素之一，可能與高齡患者絕經后體內雌激素水平明顯降低，生殖系統保護能力變弱，容易受到HPV的再感染，且高齡患者免疫低下，HR-HPV清除率較低。但Zappacosta等[9]卻認為較年輕患者錐切術后病變復發率高于年長患者，可能與性生活活躍、性生活時沒有正確使用安全套導致HR-HPV再感染有關。本研究中，年齡≥45歲和年齡<45歲的病變復發率分別為11.4%（14/123）和9.7%（9/93），差異無統計學意義（P=0.688），與趙花等[10]研究結果相符合。有研究表明，LEEP術后復發率高于CKC[11]，可能是因為LEEP手術時所產生的高溫會灼傷標本切緣，導致病理醫生對切緣狀態的無法評估，且LEEP手術對可疑頸管病變手術深度不夠。而本研究中LEEP手術復發率為12.6%（11/87）高于CKC的9.3%（12/129），差異無統計學意義（P=0.435）。本研究中CIN2者復發率為11.9%（7/59），CIN3者復發率為10.2%（16/157），兩者復發率比較差異無統計學意義（P=0.722），結果與劉哲穎等[12]研究相似。曾燕等[13]的研究表明，腺體的累及是錐切術后病變復發的危險因素之一，當病變累及腺體時，病變復的可能性增加。而本研究結果顯示，術后累及腺體者復發率為11.6%（16/138），未累及腺體者復發率為9.0%（7/78），兩者比較差異無統計學意義（P=0.549），腺體累及與否與病變復發無明顯相關性。Kyehyun等[14]同時采用第二代雜交捕獲（HC-Ⅱ）和HPV分型檢測隨訪錐切術后患者，發現同一亞型HPV持續感染尤其是HPV16亞型感染是錐切術后病變復發的獨立危險因素。

3.2 HPV E6/E7mRNA在錐切術隨訪中的應用價值 細胞學檢查是宮頸篩查及術后隨訪的基本方法，但其敏感度較低，且受診斷者主觀影響較大。文獻[15]研究表明，HPV分型檢測預測病變復發的準確性為71.5%，TCT檢測準確性僅為56.4%。因此HPV-DNA檢測聯合薄層液基細胞學檢查是目前常用的宮頸錐切術后隨訪方法，聯合篩查在一定程度上提高了篩查的敏感性和特異性。但HPV-DNA檢測特異度相對較低，易造成假陽性，不僅導致過度陰道鏡轉診，而且增加患者的心理負擔。文獻[16]研究表明，HPV E6/E7mRNA檢測的敏感性高于液基細胞學檢查，且HPV E6/E7mRNA檢測聯合液基細胞學檢查可明顯提高宮頸篩查的敏感性。宮頸錐切術后隨訪的目的是發現病變而不是病毒感染。HPV E6/E7mRNA檢測不僅可以反映HPV感染狀態，而且能夠預測病變發生的風險。文獻[17]研究表明，在診斷高級別上皮內病變方面，Aptima HPV E6/E7檢測與HPV-DNA檢測相比具有同樣的敏感性，但其特異性較高。文獻[18]研究表明，HPV E6/E7mRNA檢測效果優于HPV-DNA檢測。本研究HPV E6/E7mRNA和HPV-DNA診斷宮頸錐切術后病變復發的ROC曲線下面積分別為0.899[95%CI（0.810，0.987）]、0.872[95%CI（0.801，0.943）]。兩種檢測方法預測錐切術后病變復發的敏感度及陰性預測值比較，差異均無統計學意義（P>0.05），但HPV E6/E7mRNA檢測預測錐切術后病變復發的特異度及陽性預測值均高于HPV-DNA檢測，差異均有統計學意義（P<0.05）。E6、E7基因是導致宮頸癌的兩個致癌基因，當HPV病毒發生持續感染后，HPV E6、E7基因通過轉錄E6、E7mRNA編碼E6、E7癌蛋白，E6蛋白可降解p53抑癌蛋白、激活端粒酶，使細胞無限增殖并向惡性轉化;E7蛋白可結合并降解pRb，可最終造成惡性腫瘤的發生[19]。HPV E6/E7mRNA檢測是一種新型的HPV檢測方法，可以檢測到高危型別HPV的E6、E7mRNA的表達，可以區分HPV一過性感染和持續性感染，能顯著減少對不必要的一過性HPV感染的檢出[20]。術后隨訪18個月，HPV-DNA檢測陽性者累計80例，復發者中陽性20例;HPV E6/E7mRNA陽性者累計46例，其中復發者中陽性19例。HPV-DNA檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為88.40%、51.35%、24.00%、96.45%。HPV E6/E7mRNA檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為92.01%、74.19%、51.22%、98.86%，HPV E6/E7mRNA檢測的特異度及陽性預測值均高于HPV-DNA檢測。

綜上所述，宮頸錐切術后仍需要長期管理并隨訪，HPV E6/E7mRNA檢測的特異度及陽性預測值均高于HPV-DNA檢測，且HPV E6/E7mRNA在不降低病變總體檢出率的情況下可提高高級別上皮內病變的檢出率，降低HPV一過性感染的檢出率，在宮頸錐切術后的隨訪中具有一定的臨床應用價值，可以避免過度轉診陰道鏡及過度治療。但由于本研究樣本量小，還需要大樣本的研究及Meta分析來進一步驗證此結論。

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（收稿日期：2018-10-24） （本文編輯：張爽）