mTOR-自噬通路對膿毒癥小鼠海馬小膠質細胞表型的影響

莊欣琪，蔣毅，楊曼，王瑤琪，盧悅淳，呂國義，謝克亮，于泳浩△

膿毒癥是一種全身炎癥反應綜合征，主要由感染因素誘發，以炎癥系統的過度激活為主要病理特征，是機體和病原體相互作用引起的抗炎和促炎反應失衡的結果［1-2］。膿毒癥患者常出現中樞神經系統并發癥，主要表現為認知功能異常，包括注意力、學習和記憶能力降低等［3-4］。膿毒癥腦功能障礙的發病機制復雜且尚不明確，研究表明，膿毒癥可引起海馬小膠質細胞活化，在膿毒癥腦功能障礙的病理生理過程中起重要作用［5］。小膠質細胞活化后存在兩種表型：M1表型主要分泌多種促炎因子，介導炎性反應的發生發展；M2表型主要分泌抗炎因子，抑制炎癥反應的過度發生，促進組織修復［6-7］。有研究發現，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）-自噬通路可調節小膠質細胞表型轉化，是中樞炎性反應的潛在治療靶點［8］。本研究擬探討mTOR-自噬通路對膿毒癥小鼠海馬小膠質細胞表型的影響，為研究膿毒癥腦病的機制和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 主要試劑與儀器 主要試劑：mTOR抑制劑雷帕霉素（Ra）購自美國Sigma公司；抗CD86、抗CD206、抗離子鈣接頭蛋白分子（Iba）-1、抗p-mTOR、抗Beclin-1、抗微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）一抗購自英國Abcam公司；抗β-actin一抗購自美國Sigma公司；山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；熒光標記驢抗兔和驢抗大鼠二抗購自美國Jackson公司；腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、IL-10及轉化生長因子（TGF）-β酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購于美國R&D公司。BX53F熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；EnSpire酶標儀購自美國PerkinElmer公司；PowerPac 200電泳儀和Mini-PROTEAN Tetra電泳槽購自美國Bio-Rad公司。

1.1.2 實驗動物與分組 成年雄性ICR小鼠54只，6～8周齡，體質量20～30 g，購自軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所實驗動物中心，許可證號SCXK-（軍）2014-0001。將動物常規喂養1周后，按照隨機數字法分為3組：假手術組（Sham組）、膿毒癥組（CLP組）和膿毒癥+mTOR抑制劑雷帕霉素組（CLP+Ra組），每組18只。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥模型的制備 參照文獻［9-10］采用盲腸結扎穿孔法（CLP法）建立小鼠膿毒癥模型。腹腔注射2%水合氯醛（15 mL/kg）麻醉，腹部備皮消毒后，沿腹中線切開皮膚、腹壁約1 cm，以無菌無齒鑷探查至盲腸，于回盲瓣下方盲腸近段1/4處用手術縫線結扎盲腸，用20 G無菌針頭分別于結扎盲腸頭尾端穿孔，并擠出腸內容物約0.3 mL，將盲腸和擠出內容物一起還納腹腔，取無菌手術線逐層縫合切口。Sham組僅進行開腹及盲腸游離，不進行盲腸結扎及穿孔。術后頸部皮下注射生理鹽水0.05 mL/g復蘇。CLP+Ra組參照文獻［11］于造模前6 h腹腔注射雷帕霉素1.5 mg/kg，Sham組和CLP組腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 免疫熒光染色法檢測海馬組織切片Iba-1/CD86和Iba-1/CD206陽性細胞表達數量 于CLP后24 h，各組取6只小鼠，深麻醉下處死，左心室灌注等滲生理鹽水，至右心耳流出清亮液體，斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，20%及30%蔗糖溶液梯度脫水，用切片機行冠狀面冰凍切片，切片厚度10μm。隨后經PBS沖洗，微波抗原修復，血清封閉，滴加Iba-1一抗（稀釋度為1∶500），4℃孵育過夜。復溫后經PBS沖洗，滴加熒光（R-PE）標記的驢抗兔二抗（稀釋度為1∶1 000）避光孵育1 h，PBS沖洗，滴加CD86或CD206一抗（稀釋度均為1∶500），4℃孵育過夜。復溫后經PBS沖洗，滴加熒光（FITC）標記的驢抗大鼠二抗（稀釋度均為1∶1 000）避光孵育1 h，后用含DAPI的防熒光淬滅劑封片，100倍熒光顯微鏡下以海馬齒狀回作為觀察區域，Iba-1/CD86雙陽性為M1型小膠質細胞，Iba-1/CD206雙陽性為M2型小膠質細胞，計數M1和M2型小膠質細胞數量。

1.2.3 ELISA法檢測海馬TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平 于CLP后24 h，各組取6只小鼠，處死及心室灌注方法同前，斷頭取腦，剝離海馬組織，加入預冷的組織蛋白裂解液勻漿，4℃下15 000 r/min離心10 min后取上清，按照ELISA試劑盒說明書使用酶標分析儀測定海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β含量。

1.2.4 蛋白免疫印跡技術（Western blot）檢測海馬p-mTOR、LC3Ⅱ和Beclin-1表達 于CLP后24 h，各組取6只小鼠，剝離海馬取勻漿上清方法同前，采用BCA法進行蛋白定量分析，每孔取20μg蛋白上樣，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），采用濕式電轉移法將目的蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜后加入pmTOR、LC3Ⅱ、Beclin-1一抗和β-actin內參（稀釋度均為1∶1 000），4℃搖床孵育過夜。次日洗膜后加入堿性磷酸酶標記的山羊抗兔二抗（稀釋度均為1∶5 000），室溫孵育1 h，洗膜后于暗室內加入顯影劑并曝光掃描。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶與內參β-actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平，以LC3Ⅱ與LC3Ⅰ條帶灰度值的比值反映LC3Ⅱ的表達水平。

1.3 統計學方法 應用SPSS 18.0統計學軟件進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光染色檢測結果 與Sham組比較，CLP組海馬組織Iba-1、Iba-1/CD86和Iba-1/CD206陽性細胞數量增加（均P＜0.05）。與CLP組比較，CLP+Ra組海馬組織Iba-1/CD86陽性細胞數量減少，Iba-1/CD206陽性細胞數量增加（均P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1 Double immunostaining of Iba-1/CD86 and Iba-1/CD206 of microglia from hippocampus in three groups(×100)圖1 3組海馬組織小膠質細胞Iba-1/CD86與Iba-1/CD206免疫熒光雙染色結果（×100）

2.2 海馬組織炎癥因子檢測結果與Sham組比較，CLP組海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平均升高（均P＜0.05）；與CLP組比較，CLP+Ra組TNF-α和IL-1β水平減低，IL-10和TGF-β水平升高（均P＜0.05），見表2。

Tab.1 Comparison of Iba-1/CD86 and Iba-1/CD206 labeled microglia from hippocampus between three groups表1 3組海馬組織Iba-1/CD86和Iba-1/CD206標記陽性小膠質細胞計數比較 （n=6，個/視野，±s）

Tab.1 Comparison of Iba-1/CD86 and Iba-1/CD206 labeled microglia from hippocampus between three groups表1 3組海馬組織Iba-1/CD86和Iba-1/CD206標記陽性小膠質細胞計數比較 （n=6，個/視野，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與CLP組比較，P＜0.05

組別Sham組CLP組CLP+Ra組F Iba-1/CD86雙染Iba-1+14.5±3.8 82.5±9.4a 73.5±3.6a 212.992＊＊Iba-1+/CD86+10.8±3.2 72.7±7.3a 36.8±3.7ab 227.692＊＊Iba-1/CD206雙染Iba-1+15.7±2.2 81.5±7.9a 77.5±9.0a 166.955＊＊Iba-1+/CD206+5.2±1.2 9.8±1.5a 33.0±4.9ab 143.180＊＊

Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-1β,IL-10 and TGF-β levels in hippocampus between three groups表2 3組小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平的比較 （n=6，ng/g，±s）

Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-1β,IL-10 and TGF-β levels in hippocampus between three groups表2 3組小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平的比較 （n=6，ng/g，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與CLP組比較，P＜0.05

組別Sham組CLP組CLP+Ra組F TNF-α 83.8±10.2 311.5±39.5a 173.3±22.8ab 108.487＊＊IL-1β 32.3±2.4 72.6±4.2a 52.2±6.1ab 121.454＊＊IL-10 48.5±7.5 86.7±11.8a 147.2±17.2ab 90.280＊＊TGF-β 26.2±5.0 49.0±7.1a 76.3±11.9ab 51.986＊＊

2.3 Western blot檢測結果 與Sham組比較，CLP組海馬組織p-mTOR上調，LC3Ⅱ和Beclin-1表達下調（均P＜0.05）。與CLP組比較，CLP+Ra組海馬組織p-mTOR下調，LC3Ⅱ和Beclin-1表達上調（均P＜0.05），見圖2、表3。

3 討論

3.1 膿毒癥導致小膠質細胞活化 CLP法是誘發膿毒癥動物模型的金標準和經典方法，穿孔處擠出的糞便可引起腹腔感染，被結扎盲腸缺血壞死可釋放炎癥因子，引起全身炎癥反應［9］。研究發現，膿毒癥腦病小鼠海馬組織可發生小膠質細胞活化，Iba-1為其標志物［12］，分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子［5］。本研究參照課題組前期研究成果制備小鼠CLP模型［10］，與Sham組比較，CLP組Iba-1陽性細胞數量增加，TNF-α和IL-1β水平升高，提示模型制備成功。

Fig.2 The expressions of p-mTOR，LC3Ⅱ and Beclin-1 detected by Western blot assay in three groups圖2 Western blot法檢測3組p-mTOR、LC3Ⅱ和Beclin-1表達情況

Tab.3 Comparison of expressions of p-mTOR,LC3Ⅱand Beclin-1 between three groups表3 3組小鼠海馬組織p-mTOR，LC3Ⅱ和Beclin-1表達的比較 （n=6，±s）

Tab.3 Comparison of expressions of p-mTOR,LC3Ⅱand Beclin-1 between three groups表3 3組小鼠海馬組織p-mTOR，LC3Ⅱ和Beclin-1表達的比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與CLP組比較，P＜0.05

組別Sham組CLP組CLP+Ra組F LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.34±0.04 0.21±0.03a 0.66±0.06ab 169.801＊＊Beclin-1 0.45±0.06 0.30±0.04a 0.86±0.07ab 141.637＊＊p-mTOR 0.46±0.21 1.11±0.10a 0.41±0.06ab 49.633＊＊

3.2 小膠質細胞表型與自噬標志物的選擇 小膠質細胞約占膠質細胞數量的10%，屬單核巨噬細胞系，與外周單核細胞功能類似，是常駐中樞神經系統內的免疫細胞，通過持續性監測危險信號來參與正常腦實質的免疫監控［13］。一般情況下，中樞神經系統內的小膠質細胞處于靜止狀態；而在病理狀態下，小膠質細胞發生活化，并通過釋放一系列細胞因子，參與神經炎癥的發病機制［14］。神經系統內活化的小膠質細胞可以分為M1和M2兩種表型。M1型小膠質細胞占活化的小膠質細胞的絕大多數，CD86為其標志物，產生TNF-α、IL-1β、IL-6等致炎因子，是介導炎癥反應發生的主要來源；M2型小膠質細胞以CD206為其標志物，分泌IL-10和TGF-β等抗炎因子，抑制炎癥反應并發揮組織修復作用［6-7］。自噬在維持細胞內環境穩態和應對細胞內外應激等方面發揮重要作用。Beclin-1是哺乳動物中具有自噬調節作用的基因，是重要的自噬起始因子。LC3靶向定位于自噬體膜，參與自噬的形成，當自噬發生時，LC3Ⅰ經泛素樣加工修飾與磷脂酰乙醇胺結合，形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ蛋白結合并始終位于自噬小體膜上，是自噬小體的標志分子［15］。mTOR在調節細胞生長代謝方面發揮重要作用，也是自噬水平的重要調節者［16］。故筆者選擇mTOR、LC3Ⅱ和Beclin-1作為研究觀察蛋白。

3.3 mTOR-自噬通路調節小膠質細胞表型 本研究結果顯示，與Sham組相比，CLP組術后24 h小鼠海馬切片Iba-1/CD86和Iba-1/CD206陽性細胞數量增加，Iba-1/CD86陽性細胞數量大于Iba-1/CD206陽性細胞數量，TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平提高，p-mTOR水平上調，LC3Ⅱ和Beclin-1水平下調，提示膿毒癥小鼠海馬組織mTOR通路激活，自噬水平受到抑制，活化的小膠質細胞以M1表型為主，分泌促炎因子占優勢，加重炎癥反應。此前已有研究證實，中樞損傷后發生小膠質細胞活化，以M1表型占主導，提示活化的小膠質細胞是膿毒癥中樞炎性反應的重要參與者［12］。相比于CLP組，CLP+Ra組Iba-1/CD86陽性細胞數量減少、Iba-1/CD206陽性細胞數量增加，海馬組織TNF-α和IL-1β水平下降，IL-10和TGF-β水平提高，p-mTOR水平下調，LC3Ⅱ和Beclin-1水平上調，提示Ra通過抑制mTOR通路，激活自噬，小膠質細胞M1表型減少，M2型增加，減少促炎因子分泌，增加抗炎因子分泌，抑制炎癥反應。結果提示提高海馬自噬活性有利于減輕神經炎癥反應，與文獻［17］抑制自噬惡化中樞炎癥反應的結果一致。

綜上所述，抑制mTOR通路，激活自噬，可調節膿毒癥小鼠海馬組織小膠質細胞表型轉化，發揮抗炎作用。mTOR-自噬通路有望作為減輕膿毒癥腦病的治療靶點進行深入研究。