小劑量GnRH-a誘發(fā)后的促排卵方案在卵巢低儲備患者高基礎雌激素狀態(tài)下的應用

秦寧馨，沈曦，郜虹媛，葉靜，朱秀嫻，呂祁峰，陳秋菊，匡延平*

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011;2.上海交通大學醫(yī)學院，上海 200020)

在對不孕癥患者行IVF/ICSI-ET助孕過程中，我們發(fā)現(xiàn)卵巢低儲備(diminished ovarian stimulation，DOR)患者的治療尤為困難。盡管DOR目前的診斷標準多種多樣[1-2]，但由于卵子數(shù)量和(或)質量的下降[2-5]，DOR患者的多種促排卵方案均存在可用胚胎數(shù)少、臨床妊娠率低的問題[6]。

基礎FSH、基礎E2(B-E2)、AFC、AMH等常用于DOR患者卵巢儲備的預測和評估[7-10]。其中B-E2過高和過低均提示不良的臨床結局，B-E2≤73.4 pmol/L或≥275.3 pmol/L的患者往往預示卵巢反應不良、周期取消率高及胚胎種植率低[11-18]。因此我們將B-E2≥275.3 pmol/L定義為高基礎雌激素狀態(tài)。然而對DOR患者而言，由于在前次黃體期發(fā)生較早的選擇和優(yōu)勢化，使得月經(jīng)周期縮短，在月經(jīng)期往往伴隨出現(xiàn)較大的優(yōu)勢卵泡和較高的雌激素水平，因此DOR患者更容易出現(xiàn)高基礎雌激素狀態(tài)。當B-E2≥275.3 pmol/L時，普通促排卵方案效果不佳，周期取消率明顯升高，甚至有人建議考慮在月經(jīng)期直接取消周期。

DOR患者反復的高基礎雌激素狀態(tài)造成了較高的周期取消率，延誤了治療時間，給患者帶來了極大的心理負擔和經(jīng)濟負擔。基于既往研究，本中心模擬黃體期促排卵模式，在月經(jīng)期使用小劑量促性激素釋放激素激動劑(GnRH-a，0.1 mg)進行誘發(fā)，次日開始使用口服孕激素和克羅米芬(CC)聯(lián)合促性腺激素(Gn)進行卵巢促排卵，并觀察臨床結局。以期尋找更適合DOR患者高基礎雌激素狀態(tài)下的卵巢促排卵方案，為DOR患者的IVF/ICSI治療提供新思路。

資料與方法

一、研究對象

本研究納入2015年1月至2017年1月期間，于我院行IVF/ICSI治療的卵巢低儲備患者50例，并將在此期間所有IVF/ICSI周期均納入本研究，依據(jù)助孕周期B-E2水平是否升高分為兩組。

納入標準：(1)不孕癥診斷明確，有明確進行IVF/ICSI治療的指征；(2)符合卵巢低儲備的標準：①基礎FSH≥12 U/L；②AFC≤4個；③年齡≥42歲。三項中至少符合兩項；(3)至少一個IVF/ICSI周期符合B-E2≥275.3 pmol/L；(4) 近3個月未接受任何生殖激素類藥物治療者。

患者排除標準：(1)合并III度及以上的子宮內膜異位癥患者；(2)合并高泌乳素血癥患者；(3)有嚴重器質性疾病或精神疾病不適合妊娠的患者。

二、分組及治療方案

依據(jù)50例入組患者B-E2不同水平將IVF/ICSI周期分為兩組：實驗組，針對B-E2≥275.3 pmol/L的周期，從月經(jīng)周期第2～5天開始應用小劑量GnRH-a誘發(fā)后的卵巢促排卵方案；對照組，針對B-E2<275.3 pmol/L的周期，應用常規(guī)的卵巢促排卵方案。

(一)實驗組

當入組患者B-E2≥275.3 pmol/L伴或不伴優(yōu)勢卵泡出現(xiàn)，從月經(jīng)第2～5天開始應用小劑量GnRH-a誘發(fā)后的卵巢促排卵方案。月經(jīng)周期第2～5 d皮下注射醋酸曲普瑞林(達必佳，輝凌制藥，荷蘭)0.1 mg，注射后當日開始口服安宮黃體酮(MPA，浙江仙琚藥業(yè))10 mg/d和克羅米芬(CC，高特制藥，塞浦路斯)50 mg/d，注射后次日開始肌肉注射HMG(樂寶得，上海麗珠)150 U/d或225 U/d，超聲監(jiān)測、靜脈血性激素監(jiān)測方法同卵巢正常儲備患者。當有1個以上優(yōu)勢卵泡的直徑達到20 mm或3個以上的優(yōu)勢卵泡直徑達到18 mm以上時，皮下注射醋酸曲普瑞林(達必佳，輝凌制藥，荷蘭)0.1 mg并聯(lián)合肌肉注射HCG(珠海麗珠)1 000～5 000 U 以誘發(fā)排卵，誘發(fā)排卵36～38 h后在陰道超聲引導下行取卵術。

(二)對照組

當入組患者B-E2<275.3 pmol/L且月經(jīng)期無優(yōu)勢卵泡出現(xiàn)，從月經(jīng)第2～5天開始應用常規(guī)IVF/ICSI周期治療方案，依據(jù)采用方案的不同分為3個亞組：卵泡期對照組、黃體期對照組和自然周期對照組。

1.卵泡期對照組：包括安宮方案和輕微刺激方案。(1)安宮方案：從月經(jīng)第2～5天開始口服MPA 10 mg/d，同時肌肉注射HMG 75 U/d或150 U/d，促排卵治療過程中根據(jù)卵泡的發(fā)育情況和血清中的激素水平，及時調整MPA和HMG的用量，誘發(fā)排卵方法同卵巢正常儲備患者，誘發(fā)排卵36～38 h后在陰道超聲引導下行取卵術。(2)輕微刺激方案：從月經(jīng)第2～5天開始口服來曲唑片(芙瑞，江蘇恒瑞藥業(yè))2.5 mg/d×4 d，同時口服CC 25 mg/d×7 d，服藥第4 d開始每天肌肉注射HMG 75 U或隔天肌肉注射150 U，促排卵治療過程中根據(jù)卵泡的發(fā)育情況和血清中的激素水平及時調整HMG的用量，誘發(fā)排卵方法同卵巢正常儲備患者，誘發(fā)排卵34～36 h后在陰道超聲引導下取卵。

2.黃體期對照組：當患者取卵術后陰道超聲提示直徑小于10 mm的卵泡數(shù)≥3個時，術后當日開始口服CC 50 mg/d，同時肌肉注射HMG 150 U/d或225 U/d，超聲、性激素監(jiān)測方法及誘發(fā)排卵方法同安宮方案。

3.自然周期對照組：從月經(jīng)第10天或患者自測排卵試紙陽性日開始陰道超聲、血清性激素監(jiān)測卵泡。當優(yōu)勢卵泡直徑≥16 mm，E2≥734 pmol/L且LH≤20 U/L時，當晚23：00皮下注射達必佳0.1 mg或肌肉注射HCG 5 000 U誘發(fā)排卵，32～34 h后行取卵術。若夜針次日E2下降二分之一及以上，則立即安排提早取卵。若優(yōu)勢卵泡直徑≥16 mm、E2≥734 pmol/L且LH>20 U/L，則當天15：00注射GnRH-a或HCG，次日監(jiān)測血清性激素，若E2下降二分之一及以上則安排上午取卵，若下降二分之一以內或上升則安排下午取卵。

(三)常規(guī)取卵術、IVF/ICSI-ET與胚胎觀察

常規(guī)陰道消毒，在陰道超聲引導下，采用雙腔取卵針，抽取直徑>10 mm卵泡，如卵泡液中未見卵冠丘復合物，用培養(yǎng)液沖洗卵泡腔以及取卵針，再抽取。取卵后根據(jù)精子情況或既往受精情況采用常規(guī)IVF、ICSI或IVF+ICSI授精。取卵后18 h觀察受精情況，72 h觀察胚胎卵裂情況。依據(jù)形態(tài)學對72 h胚胎進行分級：I級：卵裂球大小均勻，胞質均質透明，無碎片；II級：卵裂球均勻，碎片<20%；III級：卵裂球大小不均等，碎片較多(20%～50%)；IV級：卵裂球不均等，碎片>50%。本中心采用全胚冷凍策略(freeze-all policy)，取卵周期I級及II級優(yōu)質胚胎以玻璃化方法進行冷凍保存，剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚后冷凍保存，擇期行冷凍胚胎移植(frozen embryo transfer，F(xiàn)ET)，F(xiàn)ET內膜準備方案參照常規(guī)[19]。

三、觀察指標

主要觀察指標：可用胚胎數(shù)，周期取消率=無可用胚胎的周期數(shù)/取卵周期總數(shù)×100%；次要觀察指標：正常受精卵數(shù)，卵裂數(shù)，優(yōu)質胚胎數(shù)，獲卵率=獲卵數(shù)/穿刺卵泡數(shù)×100%，卵子利用率=可用胚胎數(shù)/獲成熟卵數(shù)×100%，胚胎種植率=宮內妊娠囊數(shù)/移植胚胎總數(shù)×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠的周期數(shù)/移植周期總數(shù)×100%，累積活產(chǎn)率=活產(chǎn)數(shù)/取卵周期數(shù)×100%(均特指無剩余可用胚的取卵周期)。

四、統(tǒng)計學方法

結 果

一、患者基本信息

50位入組的DOR患者平均年齡(36.9±5.1)歲，BMI(21.4±2.3)kg/m2，平均既往移植失敗0(0，1.0)次，不孕年限4.0(3.0，6.0)年，既往妊娠0.5(0，1.0)次，既往產(chǎn)次0(0，0)次。

二、實驗組和對照組IVF/ICSI周期特征

50位患者共進行50個實驗組和128個對照組IVF/ICSI治療周期，其中卵泡期對照組92個(87個安宮方案，5個微刺激方案)，黃體期對照組19個和自然周期對照組17個。50 例患者所進行的對照組治療周期數(shù)最少為1個周期，最多為7個周期。

實驗組、卵泡期對照組、黃體期對照組三組間周期治療天數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。實驗組、卵泡期對照組和黃體期對照組HMG用藥天數(shù)分別有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，黃體期對照組顯著高于另外兩組(P<0.05)。

周期開始時FSH水平黃體期對照組高于其他三組，和其他三組之間均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；周期開始時LH水平在四組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；周期開始時實驗組E2水平高于卵泡期對照組和自然周期對照組，且均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；黃體期對照組E2水平高于卵泡期對照組、自然周期對照組，且均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；周期開始時P水平黃體期對照組高于其他三組，且均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

四組促排卵起始時的竇卵泡計數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；但自然周期對照組HCG日直徑>10 mm和直徑>14 mm的卵泡數(shù)少于其他三組，均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表1)。

三、實驗組和對照組IVF/ICSI促排卵結局

自然周期對照組獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精卵數(shù)、卵裂數(shù)和可用胚胎數(shù)及冷凍胚胎數(shù)均低于其他三組，且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。四組間獲卵率、成熟卵率、受精卵率、卵裂率、卵子利用率之間均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。自然周期對照組周期取消率高于實驗組和卵泡期對照組，且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表2)。

組 別周期數(shù)周期治療天數(shù)HMG用藥天數(shù)HMG日均用量(U)竇卵泡計數(shù)周期開始FSH水平(U/L)實驗組5011.8±3.99.8±3.5152.4±18.24.8±2.74.8±2.2卵泡期對照組9210.9±3.77.8±5.6#124.4±45.34.3±3.25.6±3.2黃體期對照組1912.7±5.412.7±5.4?170.7±54.44.6±3.49.9±5.4?自然周期對照組17///3.4±2.76.7±3.3組 別周期數(shù)周期開始LH水平(U/L)周期開始E2水平(pmol/L)周期開始P水平(nmol/L)HCG日直徑>10 mm卵泡數(shù)HCG日直徑>14 mm卵泡數(shù)實驗組503.1±1.9154.1±25.51.0(0.6,1.3)6.2±5.04.6±3.7卵泡期對照組924.3±3.244.5±10.5?#1.0(0.6,1.0)4.5±3.24.2±3.0黃體期對照組198.7±5.4177.3±50.913.7±7.0?4.3±3.24.1±3.0自然周期對照組174.9±3.434.5±23.4?#1.3(0.6,1.3)1.3±0.4?1.3±0.4?

注：與實驗組比較，*P<0.05；與黃體期對照組比較，#P<0.05；與其他組比較，?P<0.05

組 別周期數(shù)獲卵數(shù)成熟卵數(shù)受精卵數(shù)卵裂數(shù)Day3優(yōu)質胚胎總數(shù)Day3冷凍胚胎總數(shù)形成囊胚數(shù)實驗組503.8±3.3?3.3±2.8?2.8±2.6?2.7±2.5?1.6±1.5?1.6±1.5?0(0,0)卵泡期對照組923.1±2.2?3.0±2.1?2.8±1.9?2.7±2.5?1.5±1.3?1.5±1.3?0(0,0)黃體期對照組192.9±2.2?2.4±1.7?1.9±1.2?1.8±1.1?1.0±0.3?1.0±0.3?0(0,0)自然周期對照組170.7±0.40.5±0.20.3±0.10.3±0.10.2±0.10.2±0.10(0,0)組 別周期數(shù)冷凍胚胎總數(shù)獲卵率成熟卵率受精卵率卵裂率卵子利用率周期取消率實驗組501.8±1.7?53.485.384.797.854.624.0?卵泡期對照組921.5±1.3?52.596.893.596.150.026.1?黃體期對照組191.0±0.3?54.583.678.394.439.147.4自然周期對照組170.2±0.132.466.762.580.037.582.4

注：與自然周期組比較，*P<0.05

四、實驗組促排卵過程中激素特征

FSH在誘發(fā)排卵前維持在10～20 U/L之間，LH維持在1～5 U/L之間，兩者變化相對穩(wěn)定。E2水平在促排卵過程中穩(wěn)定上升，在HCG次日達到最高。P水平在月經(jīng)2～5天應用小劑量GnRH-a后先升高，后逐漸降低，至HCG日后再次升高(圖1)。

圖1 實驗組促排卵過程中激素特征

五、實驗組和對照組FET妊娠結局

妊娠結局統(tǒng)計時間截至2018年7月1日。50 例患者共形成可用胚胎248枚，包括實驗組89枚和對照組159枚。目前共解凍胚胎122枚，解凍后存活并移植122枚，包括實驗組67枚和對照組55枚。共行73個FET周期，包括實驗組42個周期和對照組33個周期，其中有兩個FET周期為各移植1枚實驗組胚胎和1枚對照組胚胎，且兩個周期移植后尿HCG均為陰性。

實驗組移植后有15例患者尿HCG為陽性，其中1例生化妊娠，14例臨床妊娠。臨床妊娠中12例宮內單胎妊娠，2例宮內雙胎妊娠。胚胎種植率23.9%(16/67)，臨床妊娠率33.3%(14/42)。14例臨床妊娠中流產(chǎn)5例、早產(chǎn)1例、足月分娩8 例。實驗組目前累積臨床妊娠率32.4%(12/37)，累積活產(chǎn)率24.3%(9/37)。

對照組移植后6例患者尿HCG為陽性，其中1例異位妊娠，5例臨床妊娠。臨床妊娠中3例宮內單胎妊娠，2例宮內雙胎妊娠。胚胎種植率12.7%(7/55)，臨床妊娠率15.2%(5/33)。5例臨床妊娠中流產(chǎn)2例，早產(chǎn)1例，足月分娩2例。對照組目前累積臨床妊娠率5.8%(4/69)，累積活產(chǎn)率2.9%(2/69).

實驗組和對照組的胚胎種植率、臨床妊娠率和繼續(xù)妊娠率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，目前累積臨床妊娠率和累積活產(chǎn)率間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

討 論

對于月經(jīng)周期縮短的DOR患者，部分會出現(xiàn)早卵泡期雌激素水平上升現(xiàn)象，并高于卵巢儲備功能正常的同齡婦女。Klein等[20]證明這一現(xiàn)象的出現(xiàn)是由于卵泡期的提前而非加速，上一月經(jīng)周期過早出現(xiàn)的卵泡選擇、優(yōu)勢化導致該周期優(yōu)勢卵泡出現(xiàn)和排卵的提早發(fā)生。在正常月經(jīng)周期婦女中，黃體期至卵泡期的轉化過程中FSH水平逐漸上升并達到一個小的峰值，這樣的激素水平變化和卵泡的募集、選擇有關。同時，抑制素B(Inhibin B，In B)是小卵泡分泌的蛋白類激素，可負反饋抑制FSH分泌。然而DOR患者由于卵巢儲備功能降低，在卵泡期和黃體期In B水平均低于同齡正常卵巢儲備婦女[21-22]，導致對FSH的抑制減弱，使黃體期至卵泡期轉換過程中的FSH峰提前幾天發(fā)生[23-24]。從而導致DOR患者提早發(fā)生的卵泡募集、選擇和優(yōu)勢化，使月經(jīng)周期縮短，甚至在月經(jīng)期出現(xiàn)直徑10 mm以上的優(yōu)勢卵泡。月經(jīng)期升高的雌激素水平可抑制FSH的分泌和釋放，進而出現(xiàn)基礎FSH水平正常但基礎E2水平升高的狀態(tài)。這種看似平衡的狀態(tài)是暫時的，隨著卵巢功能進一步下降，基礎E2水平下降且基礎FSH水平上升，達到圍絕經(jīng)期甚至絕經(jīng)期水平[13]。因此大家普遍認為，對于DOR患者，基礎E2水平上升是基礎E2水平下降的前驅階段，是卵巢儲備功能下降較早的標志[15-16]。

當基礎E2水平升高時，IVF/ICSI-ET臨床結局往往受到影響。優(yōu)勢卵泡提早出現(xiàn)、月經(jīng)周期縮短是獨立于年齡等其他因素外單獨的ART不良預后指標[25]，可以導致IVF/ICSI中較高的周期取消率。Licciardi等[11]報道B-E2>110.1 pmol/L時，臨床妊娠率下降；B-E2>220.2 pmol/L時，獲卵數(shù)降低；B-E2>275.3 pmol/L時，無臨床妊娠發(fā)生。Smotrich等[12]報道B-E2≥293.6 pmol/L時，臨床妊娠率降低，周期取消率升高；B-E2≥367.0 pmol/L時，周期取消率高達33.0%且無臨床妊娠發(fā)生。Evers等[13]報道基礎FSH正常且B-E2>220.2 pmol/L時，周期取消率比B-E2≤220.2 pmol/L的患者明顯升高(56% vs.13%，P<0.05)。Frattarelli等[14]報道B-E2≥293.6 pmol/L時，周期取消率33.9%；B-E2≥367.0 pmol/L時，周期取消率26.1%。Jiang等[15]報道基礎FSH正常時，高B-E2組活產(chǎn)率低于低B-E2組(44.0% vs.49.2%)，且在基礎FSH升高時，結論相同(17.6% vs.30.9%)。Gürbüz等[26]發(fā)現(xiàn)基礎雌激素升高的婦女，習慣性流產(chǎn)發(fā)生率更高。當月經(jīng)周期第2～4天優(yōu)勢卵泡直徑≥14 mm且B-E2≥734.0 pmol/L時，可采取月經(jīng)期取卵，一定程度上節(jié)約了患者時間，但仍然無法解決可用胚胎數(shù)少、周期取消率高的問題[27]。根據(jù)以往研究報道，DOR患者IVF/ICSI周期出現(xiàn)高基礎雌激素水平時，較高的周期取消率是難以避免和亟待解決的問題。

為解決DOR患者高基礎雌激素狀態(tài)下周期取消率高的這一難題，既往研究報道在DOR患者前次黃體期添加雌激素，可達到抑制黃體期和早卵泡期竇卵泡發(fā)育不同步的目的，使更多卵泡同步發(fā)育，誘導顆粒細胞FSH受體增加[28]。Chang等[29]對卵巢低反應患者進行研究，從前次月經(jīng)第21天開始至本次月經(jīng)第3天每天口服4 mg雌二醇，獲卵數(shù)、可用胚胎數(shù)均高于對照組。受到孕激素促排及黃體期促排在卵巢低儲備患者中切實有效的啟發(fā)[30]，本研究基于小劑量GnRH-a誘發(fā)后開始進行的卵巢促排卵策略，適用于早卵泡期卵泡發(fā)育不同步的狀態(tài)，無需雌激素預處理。可能由于在月經(jīng)期使用小劑量GnRH-a產(chǎn)生flare-up作用，使已產(chǎn)生的優(yōu)勢卵泡顆粒細胞黃素化，對外源性FSH敏感性降低，使竇卵泡有更多發(fā)育的機會。隨后聯(lián)合Gn和MPA、CC共同進行促排卵，模擬了黃體期促排卵內分泌模式但又不盡相同。本研究納入的50例DOR患者實驗組可達到和卵泡期對照組、黃體期對照組相類似的IVF/ICSI結局，可用胚胎數(shù)、周期取消率、胚胎種植率及臨床妊娠率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。本研究中周期取消率及臨床妊娠率可達到自身非高基礎雌激素狀態(tài)下的類似水平。與以往研究相比，可能提示這種促排卵方案在一定程度上提高了臨床妊娠率、降低了周期取消率。

但本研究仍有一定的局限性：(1)該研究為回顧性研究，仍需前瞻性等更有力的研究進一步驗證及支持；(2)每組誘發(fā)排卵方式不同：自然周期對照組采用GnRH-a或HCG誘發(fā)，高孕激素狀態(tài)促排卵采用GnRH-a聯(lián)合HCG誘發(fā)。包淑婷等[31]證明對于高孕激素促排卵而言，雙扳機可提高獲卵率和優(yōu)胚數(shù)。每組誘發(fā)排卵至取卵時間不同，常規(guī)取卵時間為誘發(fā)后32～36 h。Lu等[32]提出自然周期32～34 h取卵并結合E2下降水平判斷是否緊急取卵可降低提早排卵的發(fā)生率。在我中心未發(fā)表的數(shù)據(jù)中，對于高孕激素狀態(tài)下促排卵方案，誘發(fā)后36～38 h取卵的胚胎學結局可能優(yōu)于34～36 h取卵，因此本研究中各促排卵方案誘發(fā)方式及取卵時間不盡相同；(3)小劑量GnRH-a的作用機制目前仍然未能完全了解，該方案適用條件范圍也仍待繼續(xù)探索；(4)盡管移植時胚胎選擇是隨機的，但兩組胚胎解凍率仍然不同，實驗組胚胎解凍率75.3%(67/89)，對照組胚胎解凍率34.6%(55/159)，兩組胚胎解凍移植率有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。此外，由于DOR患者自身條件限制，50例患者中有8例從未進行過FET周期，其中原因包括無可用胚胎、仍在繼續(xù)進行取卵周期、反復內膜條件差取消移植、個人原因等等。由于多方面因素的限制，實驗組及對照組胚胎未能完全解凍，因此胚胎發(fā)育潛能及臨床妊娠結局的研究可能存在一定的局限性，仍需后續(xù)研究及觀察。但是不可否認的是，針對DOR患者高基礎雌激素狀態(tài)，小劑量GnRH-a誘發(fā)后的卵巢促排卵方案應用后并未明顯提高周期取消率，可達到和正常基礎雌激素狀態(tài)下常規(guī)促排卵相類似的結果，是一種可行的促排卵方案，為DOR患者的治療提供了一種新的IVF/ICSI思路和策略。