高效誘導(dǎo)人胚胎干細胞分化為表達生殖功能調(diào)控相關(guān)基因的下丘腦神經(jīng)細胞

徐瑜辰，覃蓮菊，寧松，曹孟，李真真，崔毓桂，馬翔，劉嘉茵

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科/生殖醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，南京 210029)

下丘腦是調(diào)節(jié)機體穩(wěn)態(tài)平衡的中樞，通過分泌多種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽，調(diào)控人體能量代謝、生殖功能、免疫功能、應(yīng)激反應(yīng)和晝夜節(jié)律[1-2]。下丘腦主要由弓狀核(ARC)、腹內(nèi)側(cè)核(VMH)、背內(nèi)側(cè)核(DMH)和室旁核(PVN)這幾種功能不同的核團組成[3]。人下丘腦ARC中存在表達阿片促黑素皮質(zhì)素原(POMC)和神經(jīng)肽Y/刺鼠相關(guān)肽(NPY/AGRP)基因的神經(jīng)元，這些神經(jīng)元能對與代謝相關(guān)的外周信號激素如胰島素、瘦素、饑餓素產(chǎn)生應(yīng)答，并通過分泌多種神經(jīng)肽來調(diào)控機體的食物攝入與能量消耗[4]。ARC中還有表達親吻素1(KISS1)基因的神經(jīng)元，通過分泌親吻肽(Kisspeptin)作用于促性腺激素釋放激素(GnRH)神經(jīng)元，從而影響GnRH的分泌，調(diào)控生殖功能[5-7]。此外，越來越多的研究表明，代謝因素會影響KISS1的表達[8-9]，而Kisspeptin信號通路的異常同樣會引起代謝相關(guān)疾病[10-12]。因此，深入了解下丘腦ARC中不同亞型神經(jīng)元在維持人體代謝與生殖功能平衡中的細胞生理學(xué)機制尤為重要，但目前很難直接獲得人類下丘腦神經(jīng)細胞用于體外疾病研究。

人類多能干細胞(hPSCs：包括人胚胎干細胞hESCs，以及人誘導(dǎo)多能干細胞hiPSCs)具有體外擴增能力和多向分化潛能，在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下可分化為三胚層來源的所有細胞類型[13]，包括神經(jīng)細胞[14-15]。2008年，Wataya等[16]基于小鼠下丘腦神經(jīng)細胞發(fā)育過程中的分子調(diào)控機制，在體外將小鼠胚胎干細胞(mESCs)誘導(dǎo)分化為下丘腦類型的神經(jīng)前體細胞。2015年，Merkle等[17]成功誘導(dǎo)hPSCs分化為具有分泌神經(jīng)肽功能的下丘腦神經(jīng)細胞。Wang等[18-19]開發(fā)了一種將hPSCs分化為類下丘腦弓狀核神經(jīng)細胞(HANs)的實驗方案，并證實這些神經(jīng)細胞與人體內(nèi)HANs的功能極為相似。體外定向誘導(dǎo)hPSCs分化為下丘腦神經(jīng)細胞，可有效解決研究用人類神經(jīng)細胞模型問題。

雖然以往研究證實了從hESCs或hiPSCs誘導(dǎo)分化的類HANs表達代謝相關(guān)基因如POMC、NPY/AGRP等[18-20]，但這些神經(jīng)細胞是否表達參與生殖功能調(diào)控相關(guān)基因尚未得到證實。本研究優(yōu)化現(xiàn)有體外誘導(dǎo)hESCs向類HANs分化方案，并進一步分析生殖內(nèi)分泌相關(guān)基因在分化神經(jīng)細胞中的表達情況，探討該類神經(jīng)細胞可否作為細胞模型應(yīng)用于下丘腦ARC在生殖相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的調(diào)控機制研究。

材料和方法

一、細胞及試劑

1.細胞：利用接受輔助生殖技術(shù)治療患者捐贈的冷凍女性胚胎，建立hES細胞系[21]，命名為CCRM14。經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)、南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的倫理委員會審查通過，捐獻者簽署知情同意書。

2.主要試劑：Knockout DMEM、血清替代物(Knockout Serum Replacement)、B27、N2添加物(N2-supplement)、IV型膠原蛋白酶(Collagenase IV)、中性蛋白酶(Dispase)、胰蛋白酶-EDTA[Trypsin-EDTA(0.25%)]、Natural mouse laminin(Thermo Fisher，美國)；β-巰基乙醇(β-mercraptoethanol)(Biolink，美國)；基質(zhì)膠(Matrigel)(BD Biosciences，美國)；堿性成纖維細胞生長因子(FGF-basic)(Pepro Tech，美國)；mTeSRTM1 cGMP，feeder-free maintenance medium for human ES and iPS Cells(Stem Cell，加拿大)；SB431542、Purmorphamine(Stemgent，美國)；LDN-193189、Y-27632(Selleckchem，美國)；DAPT(TOCRIS，美國)；SHH、BDNF(R&D，美國)；D-Glucose、Ascorbic Acid、Poly-L-ornithine(Sigma，美國)。所用抗體見表1。

表1 抗體信息

3.主要儀器：流式細胞儀(型號：Navios)、臺式冷凍離心機(型號：AllegraX-30)(Beckman，美國)；激光共聚焦顯微鏡(型號：C2 plus)、生物顯微鏡(型號：TS100-F)(Nikon，日本)；三氣培養(yǎng)箱(型號：Thermo-3131)(Thermo，美國)。

二、研究方法

(一)類HANs的體外誘導(dǎo)分化

體外誘導(dǎo)hESCs分化為類HANs的實驗方案包括三個主要步驟。第一步：在以小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)hESCs(CCRM14)，并在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)中純化；第二步：依次加入SB431542、LDN-193189、SHH、Purmorphamine、DAPT等分子，誘導(dǎo)hESCs分化為特異性表達NKX2-1的下丘腦神經(jīng)前體細胞(HNPs)；第三步：依次加入DAPT、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，誘導(dǎo)HNPs分化為類HANs(圖2)。

1.hESCs的培養(yǎng)：CCRM14以MEF為飼養(yǎng)層、在ESC完全培養(yǎng)基[組成：DMEM/F12、20%血清替代物、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、1%青霉素鏈霉素，10 ng/ml 堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)]中進行常規(guī)培養(yǎng)，每5～7 d傳代。

2.hESCs的純化：為去除飼養(yǎng)層對誘導(dǎo)神經(jīng)分化的影響，采用無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)對hESCs進行純化培養(yǎng)。在hESCs克隆生長至接近匯合時，加入Collagenase Ⅳ-Dispase混合液[1 mg/ml Collagenase Ⅳ∶1 mg/ml Dispase(v/v)=1∶1，DMEM/F12配制]；放入5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化約35 min；收集與MEF分離并脫落的hESCs克隆至15 ml離心管內(nèi)，待其自然沉降至管底；吸棄酶液，加入ESC培養(yǎng)基洗滌3次。按照1∶2或1∶3的傳代比例，接種于Matrigel包被的培養(yǎng)板內(nèi)，加入適量mTeSR1培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d，至hESCs 克隆接近匯合。加入0.25% Trypsin-EDTA，消化約3 min，使hESCs為單細胞；加入KSR培養(yǎng)基(組成：knockout DMEM、14.75%血清替代物、1.07% GlutaMAX、1.07%非必需氨基酸、1.07%青霉素鏈霉素、0.06 mmol/L β-巰基乙醇)中和并離心，懸浮細胞并計數(shù)。按適量密度接種細胞于Matrigel包被的培養(yǎng)板中(6孔板：1.0×106細胞/孔；12孔板：3.0×105細胞/孔；24孔板：1.5×105細胞/孔)；加入適量KSR培養(yǎng)基，并加入bFGF(10 ng/ml)和ROCK抑制劑Y27632(10 μM)培養(yǎng)約1 d。顯微鏡下觀察到hESCs細胞密度長至95%以上時，即可開始誘導(dǎo)神經(jīng)分化。

3.誘導(dǎo)hESCs分化為HNPs：將開始誘導(dǎo)神經(jīng)分化記為第1天(Day 1)。Day 1～4：加入KSR分化培養(yǎng)基(組成：KSR培養(yǎng)基、100 ng/ml SHH、2 μmol/L PM、10 μmol/L SB431542、2.5 μmol/L LDN-193189)，培養(yǎng)4 d。Day 5：加入KSR/N2混合分化培養(yǎng)基A[組成：3份KSR培養(yǎng)基、1份N2培養(yǎng)基(N2培養(yǎng)基組成：DMEM/F12、1.04% GlutaMAX、1.04%非必需氨基酸、1.04%青霉素鏈霉素、1.04% N2添加物、1.04% D-Glucose(16%)、0.2 mmol/L Ascorbic Acid)、100 ng/ml SHH、2 μmol/L PM、10 μmol/L SB431542、2.5 μmol/L LDN-193189]培養(yǎng)1 d。Day 6：加入KSR/N2混合分化培養(yǎng)基B(組成：1份KSR培養(yǎng)基、1份N2培養(yǎng)基、100 ng/ml SHH、2 μmol/L PM、10 μmol/L SB431542、2.5 μmol/L LDN-193189)培養(yǎng)1 d。Day 7：加入KSR/N2混合分化培養(yǎng)基C(組成：1份KSR培養(yǎng)基、3份N2培養(yǎng)基、100 ng/ml SHH、2 μmol/L PM、10 μmol/L SB431542、2.5 μmol/L LDN-193189)培養(yǎng)1 d。Day 8：加入N2分化培養(yǎng)基A(組成：N2培養(yǎng)基、100 ng/ml SHH、2 μmol/L PM、10 μmol/L SB431542、2.5 μmol/L LDN-193189)培養(yǎng)1 d。Day 9～12：加入N2分化培養(yǎng)基B(組成：N2培養(yǎng)基、0.02% B27、10 μmol/L DAPT)培養(yǎng)4 d。需每天更換新鮮培養(yǎng)基。至分化第12天，hESCs即分化為HNPs。

4.誘導(dǎo)HNPs分化為類HANs：Day 13加入TrypLE，消化HNPs約4 min，將細胞吹打為單細胞懸液，離心、棄上清液，加入適量N2分化培養(yǎng)基C(組成：N2培養(yǎng)基、0.02% B27、10 μmol/L ROCK抑制劑)重懸細胞并細胞計數(shù)。以適當密度(6孔板：1.0×106細胞/孔；12孔板：3.0×105細胞/孔；24孔板：1.5×105細胞/孔)接種至Poly-L-ornithine/Laminin包被的培養(yǎng)板中，加入適量N2分化培養(yǎng)基C，培養(yǎng)約3 h后更換培養(yǎng)基為N2分化培養(yǎng)基B，培養(yǎng)4天，每天更換新鮮培養(yǎng)基。Day 17開始，更換培養(yǎng)基為N2分化培養(yǎng)基D(組成：N2培養(yǎng)基、0.02% B27、20 ng/ml BDNF)，培養(yǎng)2～3周，每2天更換新鮮培養(yǎng)基，直到類HANs成熟。

(二)細胞流式分析

加入TrypLE，將hESCs和HNPs消化為單細胞，離心、棄上清，PBS重懸。加入Fixation Buffer(Biolegend)，4℃避光固定30～60 min。使用1×Permeabilization Wash Buffer(Biolegend，10×)破膜5 min，PBS重懸細胞。加入一抗，4℃孵育至少30 min，PBS洗滌后加入二抗，4℃避光孵育30 min。0.1% BSA洗滌并重懸，上機檢測。共分析3個代次(P33～35)的CCRM14及其誘導(dǎo)分化的HNPs。其中：兔多克隆抗體OCT4(1∶33)，兔單克隆抗體Nanog(1∶33)，小鼠單克隆抗體SSEA4(1∶33)，小鼠單克隆抗體Tra-1-81(1∶17)抗體用于檢測CCRM14干細胞多能性；兔單克隆抗體TTF1(NKX2-1)(1∶33)，小鼠單克隆抗體Nestin(1∶33)抗體用于檢測神經(jīng)前體細胞。山羊抗小鼠二抗(1∶100)或山羊抗兔二抗(1∶100)。

(三)細胞免疫熒光檢測

用4%多聚甲醛室溫固定在蓋玻片上培養(yǎng)的細胞30 min，PBS洗3遍，每次5 min。0.4% Triton X-100冰上破膜10 min，PBS洗3遍，使用5%BSA 37℃封閉30 min。孵育一抗4℃過夜，次日PBS 洗3遍，室溫避光孵育二抗1 h，PBS 洗滌后加入含DAPI的封片劑封片，利用熒光倒置顯微鏡觀察拍照。所用抗體如下：用于鑒定CCRM14干細胞多能性一抗：兔多克隆抗體Oct4(1∶200)、兔多克隆抗體Nanog(1∶200)、小鼠單克隆抗體SSEA4(1∶500)、小鼠單克隆抗體TRA-1-81(1∶200)；用于鑒定HNPs一抗：兔單克隆抗體TTF1(NKX2-1)(1∶200)、小鼠單克隆抗體Nestin(1∶100)、兔多克隆抗體FOXG1(1∶200)、山羊多克隆抗體SOX1(1：500)、兔多克隆抗體MASH1(1∶200)、小鼠單克隆抗體PAX6(1∶200)、兔單克隆抗體AR(1∶50)、小鼠單克隆抗體KiSS-1(1∶50)；用于鑒定類HANs一抗：小鼠單克隆抗體POMC(1∶200)、小鼠單克隆抗體NPY(1∶100)、兔多克隆抗體AGRP(1∶100)、兔單克隆抗體AR(1∶50)、小鼠單克隆抗體KiSS-1(1∶50)。二抗為山羊抗兔(1∶500)、山羊抗小鼠(1∶500)和驢抗山羊二抗(1∶200)。

(四)RT-qPCR分析基因表達

表2 RT-qPCR引物序列

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、CCRM14建系及鑒定

復(fù)蘇冷凍胚胎，培養(yǎng)至囊胚內(nèi)細胞團(ICM)出現(xiàn)，分離ICM轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)層培養(yǎng)，經(jīng)傳代、擴增，成功建立hES細胞系CCRM14。CCRM14在飼養(yǎng)層上呈克隆狀生長；免疫熒光實驗結(jié)果顯示，CCRM14表達干細胞多能性標志物 OCT4、NANOG、SSEA4、TRA-1-81(圖1A)。流式細胞學(xué)檢測結(jié)果顯示，CCRM14多能性標志物的陽性表達率依次為OCT4(97.82±0.46)%、NANOG(97.70±0.27)%、SSEA4(97.01±0.59)%、TRA-1-81(97.23±0.52)%(圖1B)。使用不含bFGF的ESC培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)CCRM14克隆，可觀察到擬胚體(EB)的形成(圖1C)。檢測EB在培養(yǎng)第0、3、7和14 d時的基因表達水平，發(fā)現(xiàn)多能性標志基因OCT4表達水平隨分化進程下降，而內(nèi)胚層標志基因SOX17、中胚層標志基因CD31以及外胚層標志基因NESTIN的表達水平則隨分化進程先增加，而后隨著向特異性組織的分化呈下降趨勢(圖1D)。以上研究結(jié)果表明：CCRM14具有典型hESCs特征。

A：免疫熒光檢測顯示CCRM14表達多能性標志物OCT4、NANOG、SSEA4和TRA-1-81，標尺=100 μm；B：流式細胞學(xué)檢測CCRM14細胞表達多能性標志物陽性率(共檢測3個代次：P33～35)；C：CCRM14體外懸浮培養(yǎng)形成EB，標尺=500 μm；D：CCRM14來源的EB三胚層分化特異標志基因SOX17(內(nèi)胚層)、CD31(中胚層)、NESTIN(外胚層)的表達情況圖1 CCRM14細胞系的鑒定

二、誘導(dǎo)CCRM14向HNPs分化并鑒定

本研究對已報道誘導(dǎo)分化方案[19]進行了優(yōu)化，即誘導(dǎo)神經(jīng)細胞誘導(dǎo)分化之前增加了hESCs純化步驟(圖2A)。MEF上培養(yǎng)的CCRM14呈類圓形克隆樣生長(圖2B-a)；使用Collagenase Ⅳ-Dispase消化之后，MEF仍然貼壁、而hESCs克隆完整游離后留下印跡(圖2B-b)。游離的純化hESCs克隆轉(zhuǎn)移至基質(zhì)膠上培養(yǎng)，初時呈鋪路石樣，后逐漸長至匯合、辨不清細胞形態(tài)(圖2B-c)。用0.25% Trypsin-EDTA消化為單細胞后接種于新培養(yǎng)皿，貼壁后細胞形態(tài)均一、伴高核質(zhì)比(圖2B-d)。分化至Day 12時，快速增殖的細胞顯示積聚重疊狀(圖2B-e)。分化至Day 34時，鏡下可見神經(jīng)細胞樣細胞(圖2B-f)。

收集Day 0和分化Day 12的細胞樣本，檢測多能性標志基因和HNPs特異基因表達情況。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示(圖3A)，Day 0細胞高水平表達干細胞多能性標志基因OCT4、NANOG；Day 12分化細胞的OCT4(P<0.0001)和NANOG(P<0.001)表達水平顯著降低，同時HNPs標志基因NKX2-1(P<0.0001)、神經(jīng)細胞標志基因NESTIN(P<0.01)、MASH1(P<0.01)和神經(jīng)前體細胞標志基因SOX1(P<0.0001)的mRNA相對表達量顯著上調(diào)；而端腦類型神經(jīng)細胞標志基因PAX6(P<0.01)、FOXG1(P=0.30)的表達水平則隨著細胞向腹側(cè)間腦細胞類型的分化而降低。免疫熒光檢測結(jié)果與RT-qPCR檢測結(jié)果一致：Day 12分化細胞均表達NESTIN、NKX2-1、MASH1和SOX1，不表達PAX6和FOXG1(圖3B)。流式細胞學(xué)檢測結(jié)果顯示，Day 12分化細胞中，(99.11±0.30)%的細胞顯示神經(jīng)細胞標志物NESTIN強陽性；同時(96.76±3.24)%的細胞顯示HNPs標志物NKX2-1強陽性(圖3C)，均高于之前報道的分化方案[19，22]。以上結(jié)果表明，本優(yōu)化方案可以更高效率分化為HNPs。

三、誘導(dǎo)HNPs向類HANs分化并鑒定

更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入BDNF，繼續(xù)誘導(dǎo)HNPs向類HANs亞群分化(圖2A)。收集Day 34細胞樣本，檢測多能性標志基因和HANs特異基因表達情況。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示：干細胞多能性標志物OCT4、NANOG的表達水平隨分化進程顯著降低(P<0.0001)；而神經(jīng)細胞標志物NESTIN(P<0.05)、ARC神經(jīng)細胞特異性標志物POMC(P<0.05)、NPY(P<0.05)和AGRP(P<0.001)的表達水平均顯著升高(圖4A)。免疫熒光檢測結(jié)果與RT-qPCR檢測結(jié)果一致：大部分 Day 34的分化細胞均高水平表達POMC、NPY和AGRP(圖4B)。以上結(jié)果表明，加入BDNF繼續(xù)誘導(dǎo)兩周以上，HNPs可分化為ARC神經(jīng)細胞。

A：體外誘導(dǎo)CCRM14向類HANs分化的流程圖。hESCs在MEF上培養(yǎng)6 d，純化后在Matrigel上培養(yǎng)4 d，然后消化為單細胞、誘導(dǎo)向神經(jīng)細胞分化(將開始誘導(dǎo)當天記為第1天)；培養(yǎng)至第12天收獲HNPs，轉(zhuǎn)移至Poly-L-ornithine/Laminin上繼續(xù)培養(yǎng)至第34天時收獲類HANs。其中ESC、mTeSR1、KSR和N2為培養(yǎng)基，Y27632(ROCK抑制劑)、bFGF(FGF-basic)、SB(SB431542)、LDN(LDN-193189)、SHH、PM(Purmorphamine)、B27、DAPT和BDNF為添加因子；B：顯微鏡下CCRM14向類HANs分化不同階段細胞形態(tài)：a，MEF上培養(yǎng)CCRM14第6天(Day-5)時形態(tài)；b，Day-4時使用Collagenase Ⅳ-Dispase游離CCRM14克隆之后的MEF；c，Matrigel上培養(yǎng)CCRM14至第3天(Day-1)的細胞形態(tài)；d，Day1時CCRM14消化為單細胞再接種、貼壁后細胞形態(tài)；e，CCRM14分化至Day12的細胞形態(tài)；f，CCRM14分化至Day34的細胞形態(tài)；標尺=500 μm圖2 體外誘導(dǎo)CCRM14向類HANs分化方案

A：RT-qPCR檢測分化Day 0和Day12細胞的多能性標志基因OCT4、NANOG；HNPs特異性標志基因NKX2-1；神經(jīng)細胞標志基因NESTIN、MASH 1；神經(jīng)前體細胞標志基因SOX1；端腦類型神經(jīng)細胞標志基因PAX6、FOXG1的表達，**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001；B：免疫熒光檢測分化Day12細胞NKX2-1、NESTIN、MASH1、SOX1、PAX6、FOXG1的表達；標尺=100 μm；C：流式細胞學(xué)檢測分化Day12細胞NESTIN、NKX2-1的陽性表達率分別為(99.11±0.30)%、(96.76±3.24)%圖3 CCRM14誘導(dǎo)分化至第12天時鑒定HNPs

四、檢測CCRM14來源的HNPs和類HANs中生殖功能相關(guān)基因的表達

我們進一步檢測分化的神經(jīng)細胞是否表達生殖功能調(diào)控相關(guān)基因。細胞免疫熒光實驗結(jié)果顯示，大部分Day12分化細胞(HNPs)和Day34分化細胞(類HANs)中，均顯著表達參與生殖功能調(diào)控相關(guān)基因KISS1和AR(圖5)。

A：RT-qPCR檢測分化Day 0和Day34細胞的多能性標志基因OCT4、NANOG；神經(jīng)細胞標志基因NESTIN；HANs標志基因POMC、NPY、AGRP的表達，*P<0.05、**P<0.01、****P<0.0001;B：免疫熒光檢測分化Day34細胞POMC、AGRP、NPY的表達；標尺=100 μm圖4 CCRM14誘導(dǎo)分化至第34天時鑒定類HANs

免疫熒光檢測分化Day 12、Day 34細胞KISS1和AR的表達；標尺=100 μm圖5 檢測CCRM14來源下丘腦神經(jīng)細胞中參與生殖功能調(diào)控相關(guān)基因的表達

討 論

維持hESCs自我更新能力和多能性最常用的體外培養(yǎng)方法是飼養(yǎng)層支持培養(yǎng)[23]。之前報道的體外誘導(dǎo)hESCs向神經(jīng)細胞分化方案中，或通過酶法利用TrypLE直接將hESCs連同飼養(yǎng)層一起消化為單細胞[19]，或通過機械法將hESCs克隆逐一挑出進行傳代及后續(xù)分化[24]，亦或直接將hESCs接種于無飼養(yǎng)層的Matrigel上進行增殖傳代用于分化[17-18，20，22]。酶法無法分離hESCs和飼養(yǎng)層細胞，不能排除飼養(yǎng)層細胞對后續(xù)誘導(dǎo)分化的影響；機械法雖能很好地分離hESCs和飼養(yǎng)層細胞，但操作難度大、耗時長，會使hESCs過長時間暴露于非培養(yǎng)環(huán)境，不利于之后的誘導(dǎo)分化；直接利用無飼養(yǎng)層培養(yǎng)成本高，且不利于規(guī)?；@得神經(jīng)細胞。

本研究中，在誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞前，增加了hESCs的純化步驟，利用hESCs、MEF對Collagenase Ⅳ和Dispase兩種酶的敏感性差異，有效地分離了hESCs和MEF，且時間短、易于操作，同時避免了飼養(yǎng)層以及過長時間暴露于非培養(yǎng)環(huán)境對后續(xù)誘導(dǎo)分化實驗的影響。本研究中誘導(dǎo)分化前的hESCs純度>97%(圖1B)；而HNPs 的NESTIN陽性率達99.11%、NKX2-1陽性率達96.76%，較先前文獻報道的80%以上的分化效率大幅提高[19，22]。本優(yōu)化方案便捷、可靠、效率高，將來可促進神經(jīng)細胞領(lǐng)域的研究。此外，我們的研究結(jié)果也表明了高純度的hESCs更易于誘導(dǎo)分化為特定細胞群體，對高效誘導(dǎo)hESCs向其它類型細胞分化具有借鑒作用。

現(xiàn)有研究表明從hPSCs分化的下丘腦神經(jīng)細胞與其在人體內(nèi)對應(yīng)的神經(jīng)細胞有著極為相似的特征和功能[17-18，25]，直接使用hPSCs誘導(dǎo)分化出的人體細胞進行基因篩選和機制研究，可克服利用動物進行研究時的耗時長、成本高等缺陷，同時也更易于獲得與人體內(nèi)研究一致結(jié)果，這為研究人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制提供了理想的細胞模型。此外，與大腦中復(fù)雜環(huán)境不同的是，體外下丘腦神經(jīng)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的復(fù)雜性低，使得在體外直接檢測化學(xué)物質(zhì)或藥物對神經(jīng)元功能的影響成為可能。目前，多種神經(jīng)發(fā)育性疾病[26]，神經(jīng)退行性疾病[27]和代謝性疾病[20，28]，已利用hPSCs成功構(gòu)建了相關(guān)的疾病模型，用于闡明疾病發(fā)生、發(fā)展的線索以重現(xiàn)病因。

本研究獲得的HNPs和類HANs，在蛋白水平上均能表達生殖功能調(diào)控相關(guān)基因KISS1以及參與雄激素應(yīng)答的基因AR，提示該類神經(jīng)細胞可作為細胞模型用于研究下丘腦神經(jīng)細胞在生殖相關(guān)疾病中的調(diào)控作用及機制，同時為研究代謝與生殖功能之間的相互影響構(gòu)建橋梁。不足的是，本研究尚未驗證獲得的類HANs是否能分泌具有生物學(xué)功能的神經(jīng)肽類激素，本研究小組將在后續(xù)研究中完善該類神經(jīng)細胞的功能鑒定。后續(xù)研究中，本研究小組將進一步驗證所獲得的類HANs的分泌功能，為建立探討生殖與代謝疾病在中樞神經(jīng)系統(tǒng)水平上的發(fā)病機制提供細胞模型。