反復植入失敗與子宮內膜容受性標志物研究進展

牛凱迪，王春雪，于月新

(北部戰區總醫院和平分院生殖醫學中心，沈陽 110003)

反復植入失敗(RIF)的原因包括母體因素和胚胎因素，母體因素所致RIF占絕大部分，包括子宮內膜病理、激素或代謝紊亂、免疫因素等，其中子宮內膜容受性異常是植入失敗的主要原因。成功胚胎植入的前提首先是類固醇激素和細胞因子調節子宮內膜的血管通透性，然后將特定的免疫細胞群招募到植入部位[1]，中間任何一個環節出現差錯就會導致胚胎植入失敗。通過研究反復植入失敗的分子機制，為進一步提高子宮內膜容受性找到解決辦法，有利于胚胎植入。本文主要針對RIF和子宮內膜容受性相關因子如粘附因子、非編碼RNA和免疫細胞進行綜述。

一、粘附因子與子宮內膜容受性

1.血小板內皮細胞粘附因子(PECAM1)：PECAM1位于子宮內膜組織的上皮細胞和基質細胞。PECAM1和同源框基因A10(HOXA10)一樣，蛋白表達水平在增殖后期開始增加，分泌中期達到峰值[2]，進一步證實PECAM1可以作為子宮內膜容受性的生物標志物。研究發現RIF組PECAM1 mRNA和蛋白水平明顯低于對照組[2]；PECAM1通過其下游轉化生長因子β1(TGFβ1)調控子宮內膜，影響胚胎植入，可用于開發RIF潛在治療方法。

2.Krüppel樣因子12(KLF12)：KLF12屬于KLF家族中鋅指轉錄因子，是由孕酮控制的下游基因[3]，可以負調節子宮內膜蛻膜化[4]。RIF可能與KLF12相關，Zhang等[5]發現分泌中期RIF患者子宮內膜樣本中異常表達KLF12。KLF12還可以抑制體外培養的Ishikawa細胞(高分化子宮內膜腺癌細胞系)白血病抑制因子(LIF)的表達，在人類子宮內膜發現了類似反應，KLF12可能通過抑制LIF來降低胚胎的粘附能力[3]。用人重組的LIF治療富含KLF12的Ishikawa細胞，可以提高胚胎粘附率[3]，降低KLF12是否會提高胚胎移植成功率有待進一步研究。

3.黏蛋白1(MUC1)：MUC1在管腔和腺上皮高度表達，可以抑制囊胚植入附著期起重要作用的黏附因子的表達。在植入窗口期，MUC1降低到相對較低的水平，進而使得胚胎和子宮內膜相容受。而在RIF女性中，MUC1水平極低。研究也證實了在RIF患者血液和子宮內膜中MUC1含量顯著低于有生育能力的對照組女性[6]。子宮內膜MUC1表達是選擇和植入活性高、質量好的囊胚所必需的[7]。因此，MUC1的大幅度減少可能破壞子宮內膜的胚胎選擇，無法維持正常妊娠。MUC1作為一種免疫調節劑來防御外來物質并保護植入胚胎[8]，其含量極度減少降低了這種保護作用，使胚胎易受攻擊。MUC1不受人口學和臨床特征影響，是一項獨立檢測子宮內膜容受性的標志[9]。由于MUC1在內膜組織和血液中有高度相關性，因此可以通過無創檢測外周血MUC1的表達來評估子宮內膜容受性[6]。

二、非編碼RNA與子宮內膜容受性

隨著微陣列和高通量測序的出現，表觀遺傳對子宮內膜容受性的調控更多地得到了證實[10]。檢測子宮內膜RNA水平，可評估進而提高子宮內膜容受性。

1.長鏈非編碼RNA(lncRNA)：lncRNA是一種長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。lncRNA幾乎參與人類生物學所有方面，從染色質結構、修飾、轉錄、翻譯，到細胞分化、細胞結構完整性、細胞周期調控等方面[11]，它通過激活基因增強子和修飾染色質復合物來控制基因表達。由于lncRNA對子宮內膜作用還不明確，只能通過與mRNA共表達來間接推斷其功能。lncRNA及其蛋白編碼共表達基因聚集在數百條通路上，其中一些是調節子宮內膜容受性的關鍵通路，如Toll樣受體(TLR)信號通路和B細胞抗原受體(BCR)信號通路。因此，這些lncRNA大多數被預測參與多種途徑，在子宮內膜容受性上發揮著重要作用。對分泌中期子宮內膜進行微陣列研究，可以得到RIF患者和對照組相應的lncRNA[10]，并進行個性化子宮內膜容受性診斷。由于一些lncRNA在外周血中保持穩定，并受到內源性核糖核酸酶保護，因此可以作為診斷和檢測的生物標志物[12]。

2.微小核糖核酸(microRNA)：microRNA是具有20到30個核苷酸的內源性非編碼RNA[13]，它能靶向阻斷mRNA翻譯或選擇mRNA進行降解，抑制轉錄后基因表達[14]，進而調節細胞發育及表觀遺傳。在子宮內膜的周期性變化情況下，多種microRNA調控上皮細胞的增殖和分化，從而調節子宮內膜容受性[15]。通過微陣列檢測RIF患者和對照組差異表達的microRNA，進一步得到靶基因和通路，從而進行相應靶點治療。miR-145可以降低子宮內膜上皮的胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)蛋白水平，減少胚胎粘附，RIF患者miR-145含量明顯高于對照組，子宮內膜miR-145抑制療法可能會提高RIF患者的移植率[16]。

3.環狀RNA：環狀RNA是一種特殊類型的內源性非編碼RNA，屬于共價閉環，有較高的穩定性和組織特異性，比其他RNA更適合作為生物標志物[17]。環狀RNA以microRNA為靶點調控基因表達進而發揮其功能。用基因芯片檢測RIF患者和有生育能力的女性，發現在RIF患者中有7個環狀RNA上調[18]。但目前環狀RNA如何在子宮內膜容受性中發揮作用仍在研究中。

三、基因多態性與子宮內膜容受性

基因多態性經常存在兩種或多種不連續的變異型或基因型或等位基因，它的發生可能是由于基因組中重復拷貝數的不同，也可能是單拷貝序列的變異，或者等位基因的轉換或替換。

1.亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)：MTHFR基因位于1號染色體的短臂上，由11個外顯子組成，對細胞分裂、胚胎發育和早期妊娠有重要作用。MTHFR基因最常見的兩種多態性MTHFR 1298A>C(rs18001131)和MTHFR 677C>T(rs18001133)[19]，可以作為評估胚胎能力的新生物標志物，增加篩選出可以妊娠的胚胎的可能性[20]。母體血管血栓的形成，可能會減少絨毛間隙的灌注，導致胎盤形成失敗，MTHFR純合或雜合基因突變導致酶活性降低，同型半胱氨酸累積[21]，更容易發生血栓。MTHFR是葉酸代謝的重要酶，可以通過母體膳食的補充來支持依賴MTHFR的細胞通路，甚至可以在進行輔助生殖技術的胚胎培養基加入葉酸[20]，這可能促進胚胎植入，減少RIF發生。

2.核因子κB(NF-κB)多態性：NF-κB調節細胞生理學許多方面如免疫、炎癥、細胞生存等[22]。NF-κB1和NF-κB p65是NF-κB的兩個關鍵二聚體。NF-κB1 94ins/del AGGT(rs2836249)是唯一已知功能的基因多態性，研究發現與健康對照組相比，RIF患者攜帶rs2836249缺失的等位基因頻率更高(P<0.01)[23]。NF-κB蛋白質表達障礙可能造成子宮內膜容受性降低，進而導致RIF。

四、免疫細胞與子宮內膜容受性

免疫細胞在子宮內膜容受性發揮著重要作用，成功植入及妊娠需要免疫平衡，這其中調控的關鍵元件是樹突細胞和調節T細胞[24]。

1.調節T細胞(regulatory T cells，Tregs)：胚胎植入和腫瘤發生在行為和機制上有很多相似之處，調節T細胞作為抗腫瘤免疫應答的主要抑制因子，對腫瘤血管生成有重要的直接作用[25]，推測其能影響子宮內膜容受性。

調節T細胞廣泛分布在外周血循環和組織中，趨化因子-趨化因子受體誘導的細胞控制著它們的分布。叉頭狀轉錄因子(forkhead/winged helix transcription factor，Foxp3)被認為是調節性T細胞的標志性分子。Diao等[26]的研究顯示，與對照組相比，RIF患者內膜Foxp3+Tregs顯著降低；用流式細胞術分析了外周foxp3+T細胞的趨化因子受體3(CXCR3)、趨化因子CC類受體4(CCR4)、趨化因子CC類受體6(CCR6)和趨化因子CC類受體7(CCR7)的表達，在對照組和RIF組中CXCR3、CCR6、CCR7表達無顯著差異，CCR4表達有顯著差異，這一結果表明，有RIF女性外周Tregs細胞的趨化傾向發生了改變。

CD4+CD25+T細胞是自然存在的調節T細胞，在維持機體對自身抗原耐受中扮演重要角色。小鼠相關研究中發現調節T細胞抑制了雄性特異性組織相容性(male specific minor histocompatibility，H-Y)抗原對胎兒的母體免疫反應[27]，而在人類的研究中又發現正常妊娠與循環淋巴細胞群中CD4+T細胞、CD25+T細胞數量增加有關。此外，體外受精-胚胎移植患者外周血中高比例Tregs與更好的妊娠結局呈正相關。

2.免疫相關因子和子宮自然殺傷細胞：腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導因子(tumor necrosis factor-like apoptosis weak inducible factor，TWEAK)是腫瘤壞死因子(TNF)配體超家族的細胞因子，由多種白細胞(單核細胞、樹突狀細胞、子宮自然殺傷細胞等)組成，TWEAK與成纖維細胞因子誘導基因(fibroblast factor inducible gene，Fn14)受體結合可以防止局部細胞毒性，促進人子宮內膜血管生成及構建免疫營養通路[24]。子宮內膜在著床期時局部免疫由Th1轉變成Th2，在此期間65%～70%的免疫細胞為自然殺傷(NK)細胞，其標志物為CD56。子宮NK細胞在正常情況下不會自發產生細胞毒性，在高Th1環境下，NK細胞對滋養細胞侵襲有殺傷毒性[28]。

RIF患者體內NK細胞數量異常，并且白介素15(IL-15)、白介素18(IL-18)等細胞因子表達失調。IL-15促進Tregs和NK細胞增殖。IL-18屬于前炎癥因子，研究中表明著床是炎癥過程，其特征是大量的生長因子和細胞因子分泌[29]。IL-15、IL-18共同促進Th2生成，下調炎癥和細胞毒性通路，進而影響螺旋動脈蛻膜化[28]。然而，過高的IL-15、IL-18會使Th2細胞轉變為Th1細胞，引起RIF免疫過度激活，同樣不利于胚胎植入。通過測量IL-18/TWEAK mRNA比率來記錄局部細胞毒性/血管生成平衡，IL-15/Fn-14 mRNA比率用于評估子宮NK細胞的活化和成熟狀態，而CD56+細胞計數同時測量它們在子宮內膜的相對含量[28]。植入前測量IL-15、IL-18、CD56可以方便制定下一步治療方案，進而對患者進行個性化胚胎移植，糖皮質激素治療子宮內膜過度激活，而黃體支持和子宮內膜局部損傷相關治療策略適合治療子宮內膜活化低的女性[28]。

五、總結

子宮內膜容受性是一個復雜過程，涉及到多種細胞因子、粘附因子、母體基因多態性及免疫狀況等方面。胚胎植入成功需要足夠的母體免疫誘導微環境，來保護半異基因胎兒免受母體免疫排斥[30]。子宮內膜因子和母體基因多態性可以作為潛在的生物標志物，來判斷子宮內膜容受性狀況，并進行下一步的相應治療。本文只是列舉了幾個與RIF相關的因子，仍有許多因子未發現或正在研究。