囊胚整體質量對凍融單囊胚移植妊娠和新生兒結局的影響

蔣益群，李東，王珊珊，陳林君，史建彬，張寧媛

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院生殖醫學中心，南京 210008)

輔助生殖技術的應用提高了多胎妊娠率以及相關的孕產婦和新生兒并發癥發生率，包括高血壓、糖尿病、出血、貧血、絨毛膜羊膜炎、泌尿生殖系統感染、早產和低出生體重[1-2]。選擇性單胚胎移植可使多胎妊娠率最小化，而囊胚越過了胚胎基因組激活階段，可淘汰部分非整倍體胚胎，有助于胚胎挑選[3-4]。基于此,單囊胚移植技術已被大多數生殖中心廣泛應用，通過選擇最具活力的胚胎來提高妊娠率，降低多胎率。

關于囊胚形態參數與妊娠結局的相關性，結論不一。有的研究認為滋養層等級最能預測新鮮或凍融周期的單囊胚移植的妊娠成功[5-6]，而另一些研究則認為內細胞團等級是成功胚胎植入和活產的有力預測因子[7-8]，還有的研究建議評估囊胚腔的擴張程度以預測妊娠結局[9-10]。本研究考慮到囊胚滋養層(TE)和內細胞團(ICM)的高度動態性、內細胞團準確觀察的困難性以及它們之間存在相互影響、相互促進的關系，我們設計了這項回顧性隊列研究，評估在單囊胚凍融周期中囊胚整體質量與妊娠結局以及新生兒結局之間的相關性。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2016～2017年在本中心進行單囊胚凍融移植患者的臨床資料。

納入/排除標準：新鮮周期促排方案為常規長方案患者；女方年齡≤38周歲；移植日子宮內膜厚度≥8 mm；體重指數(BMI)18～25 kg/m2；排除供精、供卵及PGD/PGS周期病例。

共納入984例患者。根據囊胚整體質量分為3組：A組為高質量囊胚(n=259)，B組為中等質量囊胚(n=400)，C組為低質量囊胚(n=325)。同時根據滋養層外是否存在碎片或卵裂球對C組患者進一步分組：C1組為不存在碎片或卵裂球(n=197)，C2組為存在碎片或卵裂球(n=128)。

二、囊胚培養與評分

常規促排卵及常規體外受精[11-12]后第3天，將移植冷凍后剩余胚胎轉至囊胚培養液 G2(Vitrolife，瑞典)進行囊胚培養。第5、6天(D5、D6)觀察胚胎，按照Gardner評分體系[13]對囊胚進行評分。本中心的冷凍標準為3BC和3CB及以上級別的囊胚。

本研究將高質量囊胚定義為：(3～6)AA、AB、BA；中等質量囊胚定義為：(3～6)BB、AC、CA；低質量囊胚定義為(3～6)CB、BC。

三、囊胚冷凍與復蘇

對囊胚進行激光皺縮，然后將囊胚放入平衡液(ES)中平衡10～15 min，轉入玻璃化冷凍液(VS)(KITAZATO，日本)中平衡30～60 s，轉移至冷凍載桿(Cryotop)上，然后浸入液氮。在移植當天進行囊胚復蘇，分四步，將待復蘇囊胚依次置于復蘇液(TS、DS、WS、WS)(KITAZATO，日本)中，將復蘇囊胚移入提前準備好的囊胚培養液G2(Vitrolife，瑞典)中，放入37℃、6%CO2和5%O2的培養箱內培養2 h。移植前評估胚胎的存活情況，囊胚腔重新擴張判斷為囊胚存活。

四、子宮內膜準備與囊胚移植

采用人工周期或自然周期進行子宮內膜準備。自然周期：月經規律，排卵正常者于月經周期的第12天開始陰道B超監測排卵，排卵日后第1天常規黃體支持，第5天胚胎移植；人工周期：排卵障礙者于月經第2天開始服戊酸雌二醇片(補佳樂,先靈，德國)，2～3 mg，Bid，服用10 d后開始陰道B超監測子宮內膜，當內膜厚度達到8 mm以上時開始常規黃體支持，黃體支持第6天胚胎移植。

五、妊娠判定標準

移植后14 d檢測HCG指標，陽性者于移植后28 d行B超檢查，見孕囊者確診為臨床妊娠。不足28周終止妊娠者為流產。

六、統計學方法

結 果

一、三組患者一般資料

A、B、C三組患者的女方年齡、不孕年限、不孕類型、BMI、FET內膜準備方案、移植當日內膜厚度均無顯著性差異(P>0.05)，而三組患者間囊胚冷凍時期比較有顯著性差異(P<0.05)(表1)。

組 別例數女方年齡不孕年限不孕類型原發不孕繼發不孕BMI(kg/m2)A組25930.97±3.963.47±2.50115(44.40)144(55.60)21.07±2.08B組40030.96±3.943.75±2.69200(50.00)200(50.00)21.00±2.22C組32531.11±3.953.43±2.50164(50.46)161(49.54)20.94±2.44組 別例數FET內膜準備方案囊胚冷凍時期人工周期自然周期D5D6移植日內膜厚度(mm)A組259204(78.76)55(21.24)222(85.71)?37(14.29)?9.40±1.57B組400302(75.50)98(24.50)292(73.00)?108(27.00)?9.42±1.43C組325252(77.54)73(22.46)198(60.92)?127(39.08)?9.40±1.66

注：組間相互比較，*P<0.05

二、三組患者臨床結局和新生兒結局

A、B、C三組患者間臨床妊娠率(70.66% vs.60.75% vs.44.31%，P<0.05)及活產率(61.39% vs.48.00% vs.34.46%，P<0.05)均有顯著差異；A、B、C三組患者的流產率逐漸增加，但無顯著性差異(13.11% vs.19.75% vs.22.92%，P>0.05)；三組患者間新生兒出生體重無顯著差異(P>0.05)(表2)。

三、C組患者兩個亞組比較

1.一般資料：C1、C2兩組患者間女方年齡、不孕年限、不孕類型、BMI、FET內膜準備方案、移植當日內膜厚度以及囊胚冷凍時期均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

組 別例數臨床妊娠率流產率活產率孕周新生兒體重(g)A組259183/259(70.66)?24/183(13.11)159/259(61.39)?38.21±1.653 426.73±578.80B組400243/400(60.75)?48/243(19.75)192/400(48.00)?38.02±1.643 361.80±481.65C組325144/325(44.31)?33/144(22.92)112/325(34.46)?38.45±1.633 395.98±456.61

注：組間相互比較，*P<0.05

2.臨床結局及新生兒結局比較：與C1組比較，C2組的臨床妊娠率(50.00% vs.40.61%，P<0.05)及活產率(39.84% vs.30.96%，P<0.05)均顯著升高(表4)。

注：與C1組比較，*P<0.05

討 論

在凍融單囊胚移植周期中，影響囊胚成功種植的因素有子宮內膜、囊胚質量以及患者心理因素等，其中囊胚質量是胚胎實驗室關注的最重要的指標。我們的臨床資料中顯示，高質量囊胚組D5比例顯著高于低質量囊胚組。武龍梅等[14]的研究也得出相似結果，他們回顧性分析凍融囊胚移植患者的臨床資料，D5組與D6組相比，新鮮周期的囊胚形成率、優質囊胚率均顯著增高。分析可能的原因：D6囊胚發育延遲，影響囊胚質量；優質囊胚在D5已被優先冷凍。

本研究結果顯示：隨著囊胚質量的增加，臨床妊娠率和活產率均顯著增加，流產率有降低趨勢，但無顯著性差異。Oron等[15]回顧性分析了凍融單囊胚移植周期1541例患者的臨床結局，結果顯示移植高質量囊胚相比低質量囊胚可獲得更高的臨床妊娠率和活產率。柳亞楠等[16]的研究將231例高質量囊胚與154例低質量囊胚進行比較，結果顯示臨床妊娠率(71.00% vs.42.86%)和活產率(54.55% vs.32.47%)均有顯著性差異，囊胚的質量能顯著影響妊娠結局。在一項通過形態學預測整倍體囊胚妊娠結局的研究中，作者強調整倍體囊胚總體質量、TE和ICM等級與患者妊娠結局正相關[17]。Irani等[18]的研究根據囊胚質量將701例囊胚分為好、中、差三組，其活產率和種植率有顯著性差異。Minasi等[19]還研究了1 730個囊胚的倍性狀態與形態學和形態動力學參數之間的潛在相關性，發現整倍體胚胎開始分裂、擴張和孵化的時間較短，而且高質量TE和ICM的比例較高，發育級別較高。

關于新生兒出生結局，我們的研究結果顯示：孕周和新生兒出生體重與移植的囊胚質量無顯著關聯。孟慶霞等[20]的研究也表明內細胞團和滋養層質量并不能預測新生兒出生體重。王雪等[21]的研究顯示，在單胎組中，D5和D6囊胚凍融移植后出生的新生兒孕周、出生體重和體長均無顯著性差異，同時在雙胎組中也得出相似的結果。也有研究指出，出生體重與內細胞團質量相關，因為內細胞團最終會發育成胎兒[22]。然而，出生體重的影響因素很多，包括新生兒性別、父母體重、孕婦的健康狀況以及孕期營養等。本研究中新生兒結局的樣本量相對較少，后續還需進一步排除混雜因素，做更深入研究。另有研究表明囊胚期胚胎相比于分裂期胚胎性別比有顯著性差異[23-24]，可能由于男女胚胎染色體的差異，男性胚胎較女性胚胎具有更好的發育潛能[25-26]。因此，探討囊胚質量與新生兒性別的關系，也需進一步擴大樣本研究。

在臨床工作中，我們發現形成的低質量囊胚，在滋養層外經常會出現排出的碎片或卵裂球，胚胎碎片有可能是促排卵或體外操作導致卵裂球損傷產生的，也有可能是胚胎修復機制，排出了染色體異常的卵裂球，或以碎片形式排出部分異常細胞[27-28]。我們的結果也顯示，對于存在碎片或卵裂球的囊胚，其臨床妊娠率及活產率不但沒有受到影響，反而有顯著性增加。有理由推斷，本研究中低質量組的C2亞組囊胚由于排出了染色體異常的細胞，相比于C1亞組可能有更高的整倍性。因此，我們推斷當內細胞團及滋養層質量達到一定等級時，滋養層外碎片及卵裂球不應作為一項負性指標。需要在以后的研究中對這一類型囊胚進行胚胎植入前遺傳學檢測(PGT-A)，進一步驗證這一推斷。

綜上所述，本研究表明，在凍融單囊胚移植周期中，囊胚總體質量可預測患者臨床妊娠率、活產率；同時，對于低質量囊胚，滋養層外碎片或卵裂球不應作為臨床妊娠率和活產率的負性指標。本研究沒有細分D5與D6囊胚，也沒有對TE和ICM形態進行區分比較，而且這是一項回顧性研究，因此，在以后的研究中需要有更大的隊列進行前瞻性研究來綜合考量目前的結論。