玻璃化冷凍卵子解凍后ICSI的妊娠結果相關因素

趙志明，曹明雅，趙雙丹，周亮，朱序理，王躍

(河北醫科大學第二醫院生殖醫學科，石家莊 050000)

隨著凍融技術及卵胞漿內單精子注射技術的發展，大大提高了冷凍卵子的復蘇率及受精率，卵子冷凍技術已逐漸應用于臨床。但凍融后的卵子存活率、受精率、胚胎著床率及臨床妊娠率仍有待提高[1]。哪些因素會影響卵子凍融后的發育潛能，卵子冷凍周期的臨床和實驗室因素及解凍周期的實驗室因素等對卵子的復蘇、受精及最終的妊娠結局有無影響作用，還存在爭議[2]。本研究回顧性分析卵子冷凍及解凍周期的臨床和實驗室的各種指標，探討臨床或實驗室因素對玻璃化冷凍的成熟卵母細胞解凍移植后的妊娠結局的影響。

資料與方法

一、研究對象

對2012年5月至2018年3月在我院生殖醫學科進行卵子冷凍的周期進行回顧性研究，共行90個卵子解凍周期，解凍后行ICSI受精，于受精后第3天行胚胎移植。根據是否妊娠分為妊娠組(44個周期)和未妊娠組(46個周期)。

卵子冷凍指征為：(1)取卵當天獲得的卵子數目大于25 枚，且女方配子運送障礙為其不孕原因，在預留足夠可用卵子后，冷凍保存部分成熟卵子；(2)取卵當天，無法獲得足夠可授精的精子，但夫婦拒絕接受供精，冷凍保存其全部或部分成熟卵子。均在充分知情同意的基礎上，并經倫理委員會討論通過。

二、研究方法

1.促排卵方案：采用常規控制卵巢刺激(COS)方案。根據患者年齡、基礎性激素水平、竇卵泡數目等卵巢儲備功能評價指標選擇促排方案。COS過程中，通過超聲對卵泡大小進行監測，并以血清性激素水平作為參考，根據卵泡的直徑和血清性激素水平決定扳機時機，肌注HCG(珠海麗珠制藥)5 000～10 000 U，注射后34～36 h取卵。對女方年齡、不孕年限、COS使用方案、促性腺激素(Gn)用藥天數、Gn使用量(支數)、HCG注射日(HCG日)血清雌二醇(E2)水平、獲卵數等進行統計分析。

2.脫顆粒及卵子冷凍：預培養獲得的卵母細胞，使用透明質酸酶80 U/ml對卵冠丘復合物脫顆粒，酶內時間控制在30 s內。脫顆粒后對卵母細胞進行成熟度的形態學評估。對成熟卵母細胞行封閉載體的玻璃化冷凍。室溫操作，冷凍保護劑及時間為(7.5% EG + 7.5% DMSO)平衡5 min，(15% EG + 15% DMSO + 0.2 mol/L蔗糖)至裝載時間在70 s內。記錄成熟卵母細胞數、取卵至脫顆粒時間(T1)、脫顆粒至冷凍時間(T2)。卵子成熟度=成熟卵母細胞數/獲卵數×100%，取卵至冷凍時間(T3)= T1 + T2。

3.卵子解凍及ICSI受精：卵子解凍采用快速解凍方法，步驟為1.0 mol/L蔗糖37℃1 min，0.5 mol/L蔗糖室溫2 min，0.25 mol/L蔗糖3 min，10%人血清白蛋白取卵胚胎處理液(HSA G-MOPS，Vitrolife，瑞典)5 min，并逐漸升溫至37℃。解凍后評估卵子存活情況，經培養后行ICSI，記錄存活卵子數目、解凍至ICSI時間(T4)。卵母細胞存活率=存活卵子數/解凍卵子數×100%。

4.胚胎移植和確定妊娠：ICSI后17 h觀察原核確定受精情況，第3天行胚胎評估，并選擇優質胚胎進行移植，黃體支持采用黃體酮和(或)HCG。臨床妊娠為移植后14 d檢測血β-HCG為陽性，并在移植后4周行超聲檢查可見妊娠囊及原始心管搏動[3]。記錄正常受精卵數、優質胚胎數、移植胚胎數、移植胚胎評分。正常受精率=正常受精卵數/ICSI卵數×100%；優胚率=優質胚胎數/正常受精的卵裂數×100%。

三、統計學方法

結 果

所有研究對象解凍卵數766枚，解凍后存活卵數722枚，存活率94.26%；正常受精卵數578枚，正常受精率80.06%；優胚數240枚，優胚率41.52%。移植周期76個，復蘇移植率84.44%，移植胚胎數180枚，平均移植胚胎數2.37個，種植胚胎數54枚，種植率30.00%。妊娠周期44個，移植周期妊娠率57.89%，解凍周期妊娠率48.89%。

一、妊娠組和未妊娠組一般臨床資料比較

妊娠組女方年齡、不孕年限顯著低于未妊娠組，而妊娠組的HCG日E2水平、周期獲卵數、成熟卵數顯著高于未妊娠組(P<0.05)；妊娠組和未妊娠組COS方案比較，妊娠組長方案較多，未妊娠組拮抗劑方案較多(P<0.05)；兩組間Gn用藥天數、Gn用藥量、成熟卵率無統計學差異(P>0.05)(表1)。

組 別周期數年齡不孕年限用藥方案(個)長方案拮抗劑方案超長方案Gn用藥天數妊娠組 4428.10±4.90?4.50±3.50?40#4#09.70±2.10未妊娠組4632.40±5.906.80±3.601622810.40±2.90組 別周期數Gn用藥量(支)HCG日E2(pmol/L)獲卵數成熟卵數成熟卵率(%)妊娠組 4425.20±9.2014 598.60±5 181.67#21.70±14.80?19.50±13.10?90.74±10.50未妊娠組4631.40±12.009 392.81±6 868.4112.10±10.9011.00±10.8086.16±14.55

注：與未妊娠組比較，*P<0.05，#P<0.01

二、妊娠組和未妊娠組實驗室資料比較

90個解凍卵子周期中，未移植周期14個，均為解凍1～4個卵子，其中8個周期無存活卵子，6個周期胚胎質量差未移植。妊娠組脫顆粒至冷凍時間(T2)顯著短于未妊娠組(P<0.05)；卵子存活率、正常受精率、優胚數、優胚率、移植胚胎的評分比較，妊娠組均顯著高于未妊娠組(P<0.05)；兩組間T1、T3、T4、解凍卵數、存活卵數、正常受精卵數、移植胚胎數目均無統計學差異(P>0.05)(表2)。

三、T1、T2、T3、T4與實驗室結局的相關性

T1、T2、T3和T4的時間范圍分別是1.13～7.20 h、0.67～5.00 h、3.83～8.47 h和0.50～5.33 h。T1與T2呈負相關(r=-0.615，P=0.000)，與T3呈正相關(r=0.615，P=0.000)；T1與優胚數、優胚率呈正相關，T2與卵子存活率、優胚數、優胚率呈負相關，T3與卵子存活率呈負相關，T4與正常受精率呈負相關；卵子冷凍周期的成熟卵數與解凍卵數、存活卵數、正常受精卵數、優胚數呈正相關，卵子解凍周期的優胚率與存活率、正常受精率、優胚數、移植胚胎評分呈正相關(表3)。

組 別周期數ICSI周期數移植周期數T1(h)T2(h)T3(h)T4(h)解凍卵數存活卵數妊娠組 4444442.90±1.852.82±1.25?5.72±1.503.76±1.339.30±5.809.10±5.50未妊娠組4638322.39±1.053.66±1.066.05±0.884.18±0.487.70±5.707.00±5.80組 別周期數存活率(%)正常受精卵數正常受精率(%)優胚數優胚率(%)移植胚胎數移植胚胎評分妊娠組 4498.54±2.86?8.00±4.8089.91±11.00?3.90±2.60#52.25±20.57?2.55±0.508.55±2.02#未妊娠組4684.24±30.385.40±4.3070.07±32.771.60±2.0031.06±34.962.13±0.815.50±2.19

注：與未妊娠組比較，*P<0.05，#P<0.01

表3 T1、T2、T3、T4與實驗室結局的相關性(r值)

注：相關性分析，*P<0.05，#P<0.01

討 論

人類卵子冷凍技術成熟的標志是其妊娠率和出生率接近于新鮮周期。但由于人類成熟卵母細胞的自身特點，如形態及結構較胚胎復雜，體積大、含水多，質膜通透性與穩定性差，冷凍過程中由于體積與表面積比較大造成脫水困難易形成冰晶，復蘇過程中容易死亡，且紡錘體對冷凍過程的低溫非常敏感，影響了染色體的重新排列，從而使卵母細胞冷凍的應用受限[4]。但是玻璃化冷凍技術的應用，對卵母細胞冷凍的普及和發展起到關鍵作用。目前卵子冷凍主要應用在以下幾個方面：(1)促排卵患者取卵日男方取精失敗或是不能獲得足夠用于授精的精子；(2)人類卵子庫的建立，為供卵項目提供便利；(3)腫瘤患者治療前卵子儲備；(4)常規卵巢刺激周期中，若獲卵多可將部分卵子冷凍保存；(5)避免因胚胎冷凍產生的倫理及立法限制；(6)延遲生育年齡；(7)為卵巢低反應患者累積卵子[5-7]。

許多因素可能影響人類卵子的冷凍結局，如女性的年齡、不孕年限，不同的促排卵方案等。而卵母細胞的體積大小、質量優劣、所處的成熟階段以及其周圍包繞的顆粒細胞等都可能會對卵子冷凍后復蘇的存活、受精及隨后的卵裂造成極大的影響[8-10]。高質量的卵子冷凍復蘇后存活率高，低質量的卵子則復蘇存活率低。Rienzi等[11]對450對夫婦的486個周期進行回顧性分析，共2 721枚卵子解凍，復蘇率84.7%；共ICSI 2 182枚卵子，受精率和優質胚胎率分別為75.2%和48.1%；周期出生率和移植周期出生率為26.3%和29.4%。通過邏輯回歸分析發現，女方年齡、冷凍的卵子數目、移植天數會影響出生率。冷凍卵子數目≤8枚和8枚以上的出生率分別為22.6%和46.4%。年齡>38歲與≤38歲的女性出生率分別為12.6%和27.5%。而當有>8枚卵子且進行囊胚培養移植和卵裂期移植時，年齡>38歲與≤38歲的女性出生率為62.1%和40.7%。本研究發現，妊娠組的年齡、不孕年限、基礎FSH水平都比非妊娠組低，而HCG日E2水平、獲卵數和成熟卵數比非妊娠組高。隨著獲卵數、雌激素水平和成熟卵子數目的增加，解凍卵子后可供選擇的機會也相應增加，使得正常受精及優質胚胎增多。解凍卵子的正常受精率與凍存前卵子的成熟程度呈正相關，說明卵子成熟程度越高，卵子的質量越好，解凍后卵子的正常受精率越高，優胚數、優胚率也越高，最終移植時胚胎評分越高，胚胎質量也越好，妊娠機會增大。

成熟卵母細胞要在最佳時間受精，因此對凍融卵母細胞的冷凍時間也應嚴格限制。尋求最佳的冷凍時機及解凍后的ICSI時機可能是提高成熟卵母細胞玻璃化冷凍質量及改善輔助生殖結局的關鍵。有學者認為成熟卵母細胞玻璃化冷凍的最佳冷凍時機是取卵后2 h內[12]。本研究發現，取卵至脫顆粒時間(T1)與優胚數、優胚率呈正相關，說明適當延長取卵至脫顆粒時間可能增加MII卵子的比例，或是對胞質的成熟有益；但也不能過度延長培養時間，否則會造成卵子老化。妊娠組脫顆粒至冷凍時間(T2)明顯短于非妊娠組，分別為2.82 h和3.66 h(P<0.05)；T2與取卵至冷凍時間(T3)正相關，與卵子復蘇存活率、優胚數、優胚率呈負相關，說明卵子存活率受時間的影響，脫顆粒后卵子可能發生老化，質量下降，冷凍復蘇的效果不好，繼而影響優胚率，可供選擇的好的胚胎減少。即使存活，形成的胚胎質量也下降，因此適當要縮短脫顆粒至冷凍時間。Porcu[13]也認為，大卵齡的卵子凍存復活率、受精率減低，畸形受精和多倍性增加。此外，凍融卵母細胞的受精時間(不含冷凍保存的時間)為注射HCG后40 h，是行ICSI的最佳時間，可以獲得高質量的卵母細胞[14]。研究已證實，玻璃化冷凍成熟卵母細胞解凍后紡錘體的完全重建需要2 h。因此，解凍后的孵育時間應為2 h[15]。目前一般控制解凍至ICSI時間在3 h內，本研究妊娠組解凍至ICSI時間平均為3.76 h。取卵10 h后卵母細胞的發育能力下降。ICSI的代謝老化依賴于：HCG注射后取卵時間，冷凍前預培養時間，解凍到受精時間。取卵后至冷凍前的預培養時間在避免注射老齡卵母細胞上有著重要的作用。冷凍前過度延長培養時間，卵膜滲透率等特性會隨著時間改變，可能會影響卵母細胞冷凍后的能力，因此建議卵子必須在取卵后的8 h內進行冷凍保存[13]。

總之，卵子冷凍周期女方年齡及成熟卵數對卵子解凍周期的妊娠結局有重要影響作用。適當延長取卵至脫顆粒時間、縮短脫顆粒至冷凍時間可能通過使卵胞質進一步成熟、降低脫顆粒后卵子老化，而提高卵子解凍存活率及發育潛能。