Cfap43基因缺陷小鼠組織病理學研究

余怡，王家雄，馬勇，許偉偉，王瑋，李紅，楊慎敏

(南京醫科大學附屬蘇州醫院生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

嚴重弱精子癥除環境、生活方式等特異性因素外[1]，與精子尾部超微結構異常有關，而這些超微結構的異常往往提示患者自身存在著遺傳缺陷，如原發性纖毛運動障礙(primary ciliary dyskinesia，PCD)、精子鞭毛多發形態異常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella，MMAF)、成人型多囊腎(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)等。其中PCD與ADPKD患者的遺傳缺陷不僅影響了精子質量與男性生育力，更關鍵的是這些缺陷對其他臟器的嚴重不良影響。PCD患者常伴有慢性呼吸道癥狀，而ADPKD患者雙側腎臟出現廣泛的囊性改變。MMAF患者表型與PCD類似，其精子在光學顯微鏡下表現尾部短而粗、僵直等特征，早年間學者將其稱為“短尾”(short tail)、“殘段尾”(stump tail)或纖維鞘發育不良(dysplasia of the fibrous sheath，DFS)[2-3]，MMAF患者遺傳缺陷的研究較PCD與ADPKD少。本課題組曾報道Cfap43基因缺陷的MMAF[4]，而近來也有MMAF新致病突變基因的報道[5]。本研究通過構建Cfap43缺陷的小鼠，對其精子表型以及生殖系統及非生殖系統的臟器進行了組織病理檢查，旨在探討Cfap43在弱精子癥發生發展中的作用。

材料與方法

一、實驗動物與儀器試劑

1.實驗動物：8周齡C57BL/6品系雄性小鼠(野生型)3只(購自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司，SPF級)。

2.主要試劑儀器：引物(南京金思瑞)；核酸提取試劑盒(BIMAKER，美國)；胚胎緩沖液(GMOPS，Vitrolife，瑞典)；2.5%戊二醛電鏡固定液(Life Science，美國)；Boin固定液(Life Science，美國)；環氧樹脂Epon 812(SPI，美國)；PCR儀(Biometra Tadvanced 96，德國)；Sanger測序儀(ABI 3500，美國)；光學顯微鏡(Nikon Eclipse E100，日本)；透射電鏡(TECNAI 10，Philips，荷蘭)。

二、實驗方法

1.基因敲除小鼠構建：參照本課題組之前的方法[4]，使用CRISPR/Cas9技術生成了Cfap43敲除小鼠。

2.基因型鑒定：8周齡小鼠剪尾，使用核酸提取試劑盒提取鼠尾DNA，參照試劑盒說明書，配置20 μl體系后行PCR。引物序列：F：5’-TCCTTTCTTTTTTGATGGCTCTAGC-3’；R：5’-TTCTATCTTCATGGGCTTCTTTGCT-3’。反應產物行Sanger測序后，使用FINCHTV軟件與NCBI網站分析測序結果。

3.精子形態檢測：胚胎緩沖液37℃預熱，將Cfap43(-/-)小鼠與WT小鼠解剖取出附睪剪碎置入EP管，加1 ml預熱的緩沖液，37℃水浴10 min，使精子游離，鑷子夾去附睪組織，400g離心15 min，棄上清，加入PBS洗滌，離心沉淀進行精子涂片，剩余沉淀加入2.5%戊二醛固定過夜，PBS緩沖液沖洗2次，每次15 min，之后經過1%鋨酸后固定1 h，再經過PBS緩沖液沖洗2次，每次15 min，2%醋酸鈾染色，乙醇逐級脫水，100%丙酮置換，用環氧樹脂Epon 812包埋，切片機超薄切片，醋酸鈾與檸檬酸鉛雙重染色，最后在透射電鏡下觀察精子尾部超微結構。

4.組織病理學檢測：解剖Cfap43(-/-)小鼠與WT 小鼠，取肝、脾、肺、腎、腦、小腸，4%多聚甲醛固定過夜，睪丸、附睪用Bouin固定液固定過夜。經梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，比較病理學差異。腎、小腸的電鏡檢測過程同上述精子的電鏡檢測過程。

結 果

一、小鼠基因型鑒定

按照人類的表型，我們通過CRISPR/Cas9技術構建了Cfap43基因第20號外顯子上的一個2 bp的刪除，從而導致移碼突變并終止了Cfap43 的轉錄，Sanger測序對小鼠基因型鑒定，與構建模型吻合(圖1)。

A：在Cfap43上構建了2 bp的刪除(紅色)；B：2 bp的刪除造成的移碼突變直接導致了轉錄的提前終止，cDNA中的終止子用*表示；C：Sanger測序鑒定小鼠基因型，與構建方案吻合，2 bp缺失的位置如方框所示圖1 Cfap43缺陷小鼠構建和鑒定

圖2 兩組小鼠精子形態學結果(HE染色，×40)

二、兩組小鼠的精子形態

WT小鼠精子的頭部呈鐮刀狀，鞭毛較長。與WT小鼠相比，Cfap43基因缺陷小鼠精子尾部則出現短、粗、卷曲甚至缺失等異常(圖2)。透射電鏡下觀察，兩組小鼠精子頭部差異不明顯，但尾部超微結構顯示：WT小鼠精子纖維鞘排列整齊，內部中央微管與外周微管呈現經典的“9+2”結構；而Cfap43(-/-)小鼠，精子尾部出現程度不一的結構紊亂，如纖維鞘的增厚，纖維鞘、外周致密纖維、微管的排列異常與數目異常等(圖3)。

三、兩組小鼠各組織病理學特征

生殖系統方面，WT小鼠與Cfap43(-/-)小鼠附睪內的精子數無明顯差異。WT小鼠附睪內精子發育成熟，有明顯的正常尾部鞭毛(圖4A)，而Cfap43(-/-)小鼠附睪內成熟精子較少，且精子尾部出現粗、短等明顯的MMAF表型(圖4C)；睪丸內，WT小鼠睪丸的各級生精細胞排布整齊，有較多正常的長形精子(圖4B)，而Cfap43(-/-)小鼠生精細胞精子鞭毛發育異常，未見正常的長形精子，但精子頭部的變形和濃縮未見明顯異常，可見正常殘余體(residual body，RB)的存在(圖4D)。

Cfap43(-/-)小鼠的肝臟組織與WT組相比無明顯差異，肝小葉完整，中央靜脈存在，肝內膽管未見明顯擴張，肝細胞未見明顯充血、水腫，肝臟未見纖維化；Cfap43(-/-)小鼠的脾臟組織白髓與紅髓結構正常，小梁間血管排列緊密，與WT組相比無明顯差異；Cfap43(-/-)小鼠的肺臟組織，鏡下可見各級支氣管、肺泡管、肺泡及肺泡囊結構整齊，肺泡內未見明顯滲出，肺間質未見明顯炎癥細胞浸潤，與WT組相比無明顯差異；Cfap43(-/-)小鼠的腎臟組織腎小體與腎小管結構完整，排列整齊，未見明顯充血、水腫、纖維化，與WT組相比無明顯差異；Cfap43(-/-)小鼠的大腦皮質與海馬體排列結構正常，未見明顯神經細胞萎縮等異?，F象，與WT組相比無明顯差異；Cfap43(-/-)小鼠的小腸組織的各層結構排列整齊，腺體無明顯萎縮，管腔見較多的環形皺襞與絨毛，與WT組相比無明顯差異(圖5)。

圖3 兩組小鼠精子的透射電鏡圖

★示附睪內正常鞭毛精子；▲示附睪內MMAF表型；示正常長形精子；→示睪丸生精細胞鞭毛異常；?示精子頭部變形和濃縮；示正常殘余體圖4 小鼠睪丸與附睪病理圖片(HE染色，附睪×50；睪丸×80)

透射電鏡下觀察，兩組小鼠的小腸腸腔表面均分布有緊密排列的正常微絨毛結構，兩者對比未見明顯差異。兩組小鼠的腎小管(近曲小管)有著緊密排列的的微絨毛，兩者對比亦未見明顯差異(圖6)。

A：肝、肺、腎組織(HE染色，×20).B：腦組織(HE染色，×5)及脾、小腸組織(HE染色，×10)圖5 兩組小鼠各組織切片病理結果

圖6 兩組小鼠部分非生殖器官的電鏡圖

討 論

纖毛/鞭毛組織在人體內廣泛分布于聽覺器官、視覺器官、呼吸道上皮、肝臟、腎臟、輸卵管、睪丸組織等，其在各組織內的作用有所不同[6]。哺乳動物通過纖毛運輸來實現視覺色素的更新，因此纖毛組織的受損會影響視覺功能。氣管與支氣管上皮細胞表面存在著許多纖毛柱狀上皮，這些纖毛規律地擺動能夠及時清除異物組織及粘液[7]。肝臟、腎臟等部分實質器官中，纖毛組織能夠起到調控液體流動的作用，當相關基因突變時，纖毛的這種調控機制出現紊亂，引發器官的囊性病變[8]。在輸卵管中，纖毛組織在性激素的調控下，周期性地發生擺動，加速卵子或受精卵的移動。在睪丸組織內，鞭毛作為精子的重要組成，是精子運動不可缺少的部分，任何影響精子鞭毛結構的基因突變，均可引起精子活動力的下降甚至導致精子不活動[9]。

MMAF是一類鞭毛發育異常引起的功能性疾病，主要表現為精子尾部的粗、短、卷曲等形態異常，電子顯微鏡下觀察，整個精子鞭毛組裝均出現異常[10]，包括纖維鞘、線粒體鞘的發育不良，微管的缺失與排列異常，外周致密纖維的數目與排列異常等[11]。本課題組通過全外顯子組測序的方法鑒定出中國MMAF患者的疾病相關基因Dnah1、Ccdc39、Cfap43、Cfap44和Cfap65[4]。此后在國際上報道了Cfap43導致的MMAF新病例。據目前文獻來看，Cfap43是除DNAH1之外MMAF最為常見的致病基因，而Cfap43的功能尚不完全明確。Coutton等[12]對MMAF的研究中發現，Dnah1、Cfap43、Cfap44基因突變的病例占到其病例總數的28.2%，這也提示深入研究這三種基因的潛在功能對于更好地理解MMAF的發病有重要的作用。近年來MMAF受到了學者們的關注，近期又報道了MMAF的新致病基因Cfap69[5]以及最新報道的Cfap251[13-14]。這些研究均著眼于目的基因對精子鞭毛的影響，涉及對其他臟器的潛在威脅。本研究發現，Cfap43缺陷的小鼠其精子出現典型的MMAF表型，其睪丸病理提示生精功能存在異常，但是其他臟器的組織病理無顯著異常。有研究發現，Cfap43基因高表達于成年小鼠睪丸中[15]，其他組織相對較少或不表達，這或許可以解釋Cfap43缺陷導致的MMAF并不一定會伴隨著其他臟器的疾病。

CFAP43蛋白首次在牛精子中心粒被鑒定[16]，之后發現在人類精子也存在CFAP43蛋白[17]。CFAP蛋白是一類纖毛中高度保守的蛋白，其結構中富含WD重復結構域，而這種結構域在精子鞭毛內運輸(intraflagellar transport，IFT)蛋白中高度富集[18]，提示其在精子鞭毛形成過程中的重要作用[19]。IFT蛋白將位于胞質合成的重要蛋白運送到軸絲部位，參與動力蛋白臂的合成，其在精子鞭毛發生中發揮了重要的作用。CCDC39基因突變引起纖毛內側動力蛋白臂的缺失，文獻報道該基因與PCD有較大關聯[20]。據統計。PCD男性病例中，約有76%病例同時表現為弱精子癥[13]，而這部分患者中精子形態學表現為MMAF的比例并不清楚。

本研究中，我們僅對部分實質器官進行了形態學研究。除睪丸與附睪組織外，其他臟器組織并未發現有明顯的異常。CFAP43在肺組織中有一定的表達[15]，而肺的各級支氣管的表面分布著呈柱狀的纖毛組織，擺動的纖毛負責清除粘液與異物組織[7，21]。CFAP43作為一種結構蛋白，其在精子鞭毛形成中主要影響內側動力蛋白臂的正常結構形成[12]，但其是否影響其他運動纖毛(呼吸道、支氣管粘膜表面的運動纖毛)的正常結構與功能目前尚無研究。腎臟上皮細胞電鏡下存在著初級纖毛，與運動纖毛不同的是，初級纖毛主要起到維持細胞形態與組織完整的作用[22]，ADPKD的發生正是由于初級纖毛上的多囊蛋白(polycystin-1、2，PC-1、2)突變引起，CFAP43蛋白是否參與腎臟上皮細胞的初級纖毛結構組成，以及該蛋白突變后能否引起纖毛信號通路(cilia-dependent cyst activation，CDCA)的激活或抑制進而引起腎臟的囊性病理改變[8]，目前尚無充分研究解釋這些猜想。我們的實驗結果暫未發現Cfap43敲除小鼠腎臟組織病理表現為典型的多囊腎，后期需要更多的探索來解開這些疑問。

總結與展望：Cfap43缺陷導致精子尾部畸形，但是含纖毛的組織(肺、腎、腦)和不包含纖毛的組織(肝、脾)病理上未發現明顯影響。纖毛組織在不同的物種間具有高度的保守性，但在同一物種內，其在各器官內的分化機制卻不相同。CFAP43作為一種纖毛與鞭毛的結構蛋白，其在小鼠的各器官中表達含量不盡相同，當Cfap43缺陷時，各器官尤其是含有纖毛組織的器官病變也存在較大的差異。纖毛組織在生物體內除了起到運動功能外，其還參與細胞信號轉導的過程，而各組織細胞間存在著部分信號轉導的差異性，導致后期的生物學事件也不相同，這可能與上述器官病變的差異性有關。未來需要更多的研究去解釋這些現象。