YY1對卵巢癌細胞增殖和侵襲作用影響及其分子機制

加秋萍，梁婉琪，李芬霞，張美，趙宗霞

(西安醫學院第二附屬醫院婦產科，西安 710032)

卵巢癌是女性常見的生殖器官惡性腫瘤之一。卵巢癌的發病率及死亡率均位于我國女性生殖器官惡性腫瘤的前五名[1-2]。卵巢癌惡性程度高，極易在盆腹腔擴散轉移，預后差，5年生存率低于50%[3-4]。Yin Yang 1(YY1)是一個參與了多種惡性腫瘤轉移的癌基因[5]。人源YY1由414個氨基酸組成，是屬于一種鋅指蛋白類同時具有復雜功能的轉錄因子，YY1可將組蛋白脫乙酰酶和組蛋白乙酰轉移酶直接導入啟動子以激活或抑制啟動子，可以同時促進和抑制相應的基因轉錄。國內外研究表明YY1在具有轉移和侵襲性的腫瘤如前列腺癌、肺癌、結腸癌中高表達[6]，其過量表達與腫瘤的臨床病理分期和轉移有密切的聯系。上皮間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是早期腫瘤轉化為具有高侵襲性和高轉移性的主要機制，主要由于上皮特性的喪失和間質特性的轉換，促進了腫瘤的侵襲性[7]。研究表明，在胃癌中EMT的發生可以促進腫瘤侵襲和轉移[8]，越來越多的研究將YY1和EMT之間的相互作用作為重要研究方向。本研究采用卵巢癌患者腫瘤組織和卵巢癌細胞系HO8910PM，探討YY1是否通過促進EMT相關蛋白表達從而對卵巢癌形成轉移產生影響。

材料和方法

一、研究對象

本研究共納入本院2017年10月至2018年5月收治的85例卵巢癌患者，年齡29～63歲，平均(49.35±6.63)歲；依據國際婦產科聯盟(FIGO)分期標準：Ⅲ期68例，Ⅳ期17例；病理分型：上皮型惡性腫瘤63例(黏液型6例，漿液型48例，透明細胞腫瘤4例，子宮內膜樣腫瘤3例，移行細胞腫瘤2例)，非上皮型惡性腫瘤22例。所有卵巢癌患者均經過病理檢驗科診斷證實，所有患者取材時尚未經過任何治療。實驗方法和目的均告知患者和家屬，并簽署知情同意書，本研究獲得醫院倫理委員會批準。

二、研究方法

1.主要試劑和儀器：卵巢癌細胞系HO8910PM(中科院上海細胞庫)；胎牛血清(Gibcom，美國)，RPMI 1640培養液、0.25%胰蛋白酶(Thermo Fisher，美國)；Trans-well小室(Costar，美國)；Matrigel生物膠(BD，美國)；YY1引物、反轉錄試劑盒(Takara，日本)；Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen，美國)；Hoechst 染料(Sigma，美國)；4%多聚甲醛(北京鼎國昌盛生物技術)；結晶紫(西安國安生物科技)。

2.細胞培養：卵巢癌細胞系HO8910PM采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液于37℃、5% CO2的培養箱中常規培養，取指數生長期細胞進行實驗。

3.細胞轉染：用0.25%的胰蛋白酶消化指數生長期細胞，將細胞懸液接種于6孔板中，每孔接種的細胞數約5×105個，培養過夜，待細胞貼壁即可進行轉染。按照Lipofectamine 2000 Reagent 轉染試劑盒說明書上的實驗步驟，將50 pmol的YY1小干擾RNA(small interfere RNA，siRNA)和50 pmol的YY1陰性對照(negative control，NC)轉染到HO8910PM細胞中，4～6 h后更換培養液，48 h后提取RNA，RT-PCR檢測轉染后細胞中YY1的表達變化，并收集細胞進行后續實驗。

4.實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)：提取總RNA，定量后，反轉錄成cDNA，qRT-PCR檢測YY1的表達情況，以GAPDH作為內參，采用2-△△CT法進行相對定量分析。qRT-PCR 反應條件為：95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環。YY1引物序列(5’-3’)：正向TGGCCACTGCTGCTTCCTCTTCTT；反向GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCT。

5.細胞增殖實驗：將細胞按1×104/孔的密度接種于96孔板，設3個復孔。37℃、5%CO2培養箱內培養24 h、48 h和72 h，培養結束后每孔加入20 μl的CCK-8，再在培養箱內孵育3 h，室溫條件下于搖床震蕩10 min，酶標儀490 nm波長測OD 值。

6.Trans-well細胞侵襲實驗：配制BD膠和培養液(1：9)，冰上操作，然后在 37℃細胞培養箱孵育5 h，在 37℃細胞培養箱水化基底膜 30 min。胰蛋白酶消化指數生長期細胞，計數，無血清DMEM培養液調整細胞數為5×104/孔，Trans-well 小室下室加入正常10% 胎牛血清DMEM 培養液600 μl，接種200 μl無血清細胞懸液于24孔 Trans-well小室上室，設3個復孔。16 h后PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，室溫風干。0.1%結晶紫染色15 min，PBS洗3遍，用棉簽輕輕擦去上層未遷移的細胞，33%乙酸脫色，570 nm讀數。

7.Western blot：將濃度1×106/ml的細胞接種于6孔板中，設3個復孔。細胞貼壁取出6孔板，棄掉上清；PBS清洗1 min后加含有蛋白酶抑制劑的裂解液并吹打細胞團，后放置冰上裂解，30 min后用細胞刮將細胞刮下來轉移至1.5 ml試管中，高速離心并抽取上清，即為所提蛋白。取患者腫瘤組織液氮冷凍，隨后進行碾磨，裂解液裂解，低溫離心取上清，即為組織蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min，樣品可凍于-80℃保存。SDS-PAGE電泳后進行轉膜操作，轉膜成功后用脫脂牛奶進行封閉，PBS清洗，裁剪條帶并分別加入相應抗體，均為1：1 000稀釋，室溫孵育1 h后4℃過夜。次日反復清洗條帶，加二抗室溫孵育90 min，PBS反復沖洗，然后加ECL發光液，化學發光儀檢測并拍照。

三、統計學分析

結 果

一、YY1在卵巢癌、癌旁組織和正常組織的表達

收集卵巢癌患者手術樣本，采用qRT-PCR和Western Blot分析YY1在癌組織(OCT)、癌旁組織(PT)和正常組織(NT)中的表達情況，結果顯示，YY1在卵巢癌組織中的表達顯著高于癌旁組織和正常組織(P<0.01)(圖1)。

A：qRT-PCR檢測YY1 mRNA的表達；B：Western Blot檢測YY1蛋白的表達與其他兩組比較，*P<0.01；與NT組比較，#P<0.05圖1 YY1在卵巢癌、癌旁組織和正常組織的表達

二、干擾RNA瞬轉技術降低YY1在細胞中的表達

首先檢測了4種人卵巢癌細胞系(SKOV3、OVCAR-3、HO8910PM、A2780)中YY1的表達情況，結果發現YY1在HO8910PM細胞系表達最高(圖2A)；其次利用YY1干擾RNA及其對照轉染細胞系HO8910PM構建YY1低表達細胞系(HO8910PM-si)和對照細胞系(HO8910PM-NC)。qRT-PCR檢測轉染后YY1在mRNA水平表達情況(如圖2B)，結果顯示在卵巢癌細胞系HO8910PM中轉染干擾RNA后，YY1的表達水平下調，具有顯著性差異(P<0.05)。

三、 YY1下調后對HO8910PM細胞增殖作用影響

CCK-8試驗結果顯示，降低卵巢癌細胞YY1表達，干擾組的增殖細胞數顯著低于NC組，說明降低YY1的表達可以顯著抑制卵巢癌HO8910PM的增殖能力(P<0.01)(圖3)。

A：4種卵巢癌細胞中YY 1蛋白表達；B：YY1干擾RNA瞬轉轉染后HO8910PM細胞中YY 1 mRNA表達與其他組比較，*P<0.05圖2 YY1在不同腫瘤細胞系中表達情況

相互比較，*P<0.05，#P<0.01圖3 YY1表達下調對HO8910PM細胞增殖能力的影響

四、YY1下調對HO8910PM細胞侵襲能力的影響

Trans-well侵襲實驗結果顯示，YY1干擾組的細胞侵襲能力顯著低于NC組，說明降低YY1的表達可以顯著抑制卵巢癌HO8910PM細胞的侵襲能力(P<0.01)(圖4)。

五、YY1下調后對HO8910PM細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達的影響

Western blot檢測結果顯示，YY1干擾HO8910PM細胞與NC組相比，E-cadherin表達增高而N-cadherin和Vimentin表達顯著降低(P<0.05)(圖5)。

相互比較，*P<0.01圖4 YY1表達下調對HO8910PM細胞侵襲能力的影響

相互比較，*P<0.05圖5 YY1表達下調對HO8910PM細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達的影響

討 論

卵巢癌已經成為世界上發病率及死亡率僅次于宮頸癌的女性生殖器官惡性腫瘤，其惡性程度高，轉移率高，臨床治療效果極差，5年生存率遠低于其它腫瘤。因此，發現新的靶分子可以為提高卵巢癌治療及預后提供更好的研究方向。EMT在腫瘤侵襲和轉移中具有重要作用，越來越多的研究將EMT作為卵巢癌轉移的重要研究方向。E-cadherin和Vimentin作為EMT的關鍵分子可能受多種機制調控，如轉錄因子、mirRNA等[7-8]。因此針對EMT的深入研究，對于揭示卵巢癌轉移的分子機制和腫瘤的治療具有重要意義。

國內外研究發現YY1可以參與多種腫瘤的轉移調控[9-11]。YY1既可以通過靶向lncRNAPVT1調節肺癌的惡性病變[12-15]，也可以通過與RING1的相互作用抑制乳腺癌的增殖和轉移[16-17]。Khachigian[18]則提出YY1可以作為腫瘤治療的一個新興靶點。以上結果均提示YY1在腫瘤的形成、發展及腫瘤細胞的增殖中可能發揮重要作用，可能作為腫瘤治療的潛在靶點。

本研究為了驗證YY1在卵巢癌細胞轉移中發揮的作用，首先通過查閱數據庫分析YY1在多種惡性腫瘤中表達趨勢，結果顯示YY1在多種具有高轉移性的腫瘤如胃癌、結腸癌等高表達。通過qRT-PCR和Western Blot檢測85例卵巢癌患者腫瘤組織與癌旁正常組織中YY1的表達，發現YY1在卵巢癌組織中的表達顯著高于癌旁組織。為了進一步分析YY1在卵巢癌中的作用，采用siRNA干擾技術下調YY1在卵巢癌細胞系HO8910PM中的表達，qRT-PCR檢測干擾前后細胞系YY1的表達，結果表明YY1在mRNA水平表達被顯著降低，說明成功利用siRNA構建了YY1敲減細胞系。通過增殖、侵襲和轉移等功能實驗驗證下調YY1表達后的卵巢癌細胞的惡性生物學行為，發現卵巢癌細胞系增殖、轉移及侵襲能力顯著下調。同時通過驗證YY1與EMT相關分子的表達，發現YY1可以通過促進上皮間質轉化相關蛋白N-cadherin和Vimentin表達、抑制E-cadherin的表達來激活卵巢癌細胞EMT的發生。

通過研究結果，本研究認為YY1與卵巢癌轉移和侵襲密切相關。同時實驗數據提示，YY1可能在卵巢癌進展中具有調節EMT的重要作用，有望成為卵巢癌的治療靶點。在臨床上，這些實驗結論有望為YY1靶向基因治療卵巢癌提供部分依據。