刺梨及其近緣種質葉片主要活性物質含量及抗氧化性分析

周廣志 魯 敏 安華明

(貴州大學農學院,貴州省果樹工程技術研究中心,貴州貴陽 550025)

刺梨(Rosa roxburghii Tratt.)為薔薇科薔薇屬植物,其果實具有較高的營養保健和醫藥價值,是我國特有的并正大力開發的新興果樹,僅貴州省的種植面積已超過10 萬hm2。除果實外,刺梨葉中還含有豐富的營養物質,具有重要的醫藥和保健功能[1-2],其相關產品開發也逐漸受到人們關注[3-4]。貴州省果樹工程技術研究中心刺梨課題組前期研究表明,刺梨葉中含有較為豐富的抗氧化物質,如維生素C(Vc)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和黃酮等活性物質[5-9],其Vc 含量甚至高于草莓、芒果、桃、番茄等園藝作物[10-14]。研究發現刺梨三萜類物質對其抗氧化能力具有較大貢獻,且在體外試驗中表現出較強的抗癌作用[15-16]。目前,對刺梨果實中的活性物質鑒定的研究已有大量報道[17-19],而關于刺梨葉中抗氧化物質種類及其對抗氧化活性貢獻等方面的研究尚鮮見報道。

無籽刺梨(R. sterilis S. D. Shi)和無刺刺梨(R.roxburghii f. eseiosa Ku)是晚于刺梨被發現和開發的近緣種質。它們在植株形態、果實口感等方面與刺梨雖有相近之處,但在果實外觀、果刺有無及果實營養價值等方面與刺梨存在較大差異[18,20],具有明顯的特殊性狀和較大的開發利用潛力。雖然在資源分布地素有以其葉片為原料加工制作保健茶的傳統習慣,但對其營養物質種類的研究鮮見報道。因此,本研究以刺梨、無刺刺梨和無籽刺梨3 個種質資源的葉片為試驗材料,分析不同葉齡葉片中Vc、總三萜、總酚、總黃酮的含量和SOD 活性變化,并通過測定鐵離子還原(ferric reducing antioxidant power,FRAP)、2,2′-聯氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-amino-di(3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,ABTS]和1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl,DPPH)3 個體系的抗氧化能力,分析活性物質與抗氧化能力的相關性及貢獻,以期為刺梨、無刺刺梨和無籽刺梨葉片活性物質的系統評價及開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以刺梨(Rosa roxburghii Tratt.)、無刺刺梨(R.roxburghii f. eseiosa Ku)和無籽刺梨(R. sterilis S. D.Shi)的葉片為試驗材料,其中,刺梨和無籽刺梨的葉片采于貴州大學刺梨種質資源圃,無刺刺梨葉片采于貴州省黔西縣。采樣的植株共為20 ～90 株,實驗采取3個時期樣品,分別是生長6～10 d 的葉片(幼葉),生長60～65 d 的葉片(成熟葉),生長100 ～105 d 的葉片(老葉),3 個時期葉片樣品隨機取自樹勢基本一致的植株樹冠外圍中上部,每次采樣量均大于100 g,液氮處理后立即于-75℃保存。

1.2 試驗試劑

標準品熊果酸、沒食子酸、蘆丁和水溶性維生素E(Trolox)均購自上海源葉生物科技有限公司;福林酚(Folin-ciocalteu,Fc)試劑購自北京索萊寶科技有限公司;2,4,6-三吡啶吖嗪[2,4,6-Tris(2-pyridyl)-striazine,TPTZ]、ABTS、DPPH 試劑購自上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 Vc 含量的測定 參照王樂樂等[21]的方法,采用LC-15C 高效液相色譜儀(日本島津制作所)測定Vc 含量。

1.3.2 總三萜酸含量的測定 采用香草醛-冰乙酸法[22-23]測定總三萜酸含量,以標準品熊果酸為對照,稱取樣品0.5～1.5 g,加入15 mL 75%乙醇,50℃超聲提取50 min,8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,定容至50 mL,即為提取液,搖勻備用。吸取0.2 mL 提取液于10 mL 離心管中,依次加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1 mL 高氯酸,搖勻后于60℃水浴處理20 min,然后于冰浴冷卻,再加入10 mL 冰乙酸并充分搖勻,于545 nm 波長處測定吸光值。

1.3.3 總酚含量的測定 采用福林酚比色法[24]測定總酚含量,以標準品沒食子酸為對照(記作CK1),稱取葉樣0.5 ～1.5 g,加入15 mL 30%甲醇,超聲2 h,8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,定容至50 mL,即為提取液,搖勻備用。吸取0.05 mL 提取液于10 mL容量瓶,依次加入2.45 mL 蒸餾水、0.2 mL Fc、2.5 mL 20% 碳酸鈉,定容,室溫靜置2 h,于765 nm 波長處測定吸光值。

1.3.4 總黃酮含量的測定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[25-26]測定總黃酮含量,以標準蘆丁品為對照(CK2),稱取0.5 ～1.5 g 樣品,加入15 mL 30%甲醇,超聲提取2 h,8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,定容至50 mL,即為提取液,搖勻備用。吸取2 mL 提取液于10 mL 離心管中,依次加入0.4 mL 5% NaNO2、0.6 mL 10% Al(NO3)3、4 mL 4% NaOH,每一步均需搖勻,室溫靜置6 min,用30%甲醇定容至10 mL,再靜置15 min,然后于510 nm 波長處測定吸光值。

1.3.5 SOD 活性測定 采用氮藍四唑法[27]測定SOD活性。

1.3.6 鐵離子還原能力(FRAP)的測定 參照杜國榮[28]和Benzie 等[29]的方法,并略加改動。稱取葉樣0.5 g,加入15 mL 30%甲醇,超聲提取2 h,8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,定容至50 mL 搖勻備用。于10 mL 離心管中加入3 μL 樣品提取液和8 mL FRAP 溶液, 37℃反應10 min 后在593 nm 波長處測定吸光值。

1.3.7 ABTS 自由基(ABTS·)清除能力的測定 參照杜國榮[28]和Re 等[30]的方法,并略作改動。稱取葉樣0.5 g,加入15 mL 30%甲醇,超聲2 h,8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,定容至50 mL 搖勻備用。將5 μL 樣品提取液和5 mL ABTS 溶液加入10 mL 離心管中,避光反應10 min 后在734 nm 波長處測定吸光值。

1.3.8 DPPH 自由基(DPPH·)清除能力的測定 參照杜國榮[28]和Takebayashi 等[31]的方法,并略作改動。稱取葉樣0.5 g,加入15 mL 30%甲醇,超聲2 h,8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,定容至50 mL 搖勻備用。于10 mL 離心管中加入10 μL 樣品提取液和4 mL DPPH 甲醇溶液,反應2 h 后在517 nm 波長處測定吸光值。

上述3 種體外抗氧化性評價方法中,均同時以0.1 g·mL-1沒食子酸和蘆丁標準液代替樣品提取液作為對照。抗氧化方法結果用μmol·L-1水溶性維生素E Trolox 等量抗氧化能力(trolox equal antioxidant capacity,TEAC)表示。所有試驗均設3 次重復。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2007 進行數據統計分析;DPS v 7.05 統計軟件進行差異顯著性、相關性和主成分分析分析;多重比較采用Duncan′s 新復極差法。

2 結果與分析

2.1 5 種主要活性物質含量變化

圖1 不同發育時期刺梨葉片的Vc、總三萜、總酚、總黃酮含量和SOD 活性Fig.1 Vc, total triterpene, total phenolic, total flavonoids content and SOD activity in leaves of Rosa roxburghii at different developmental stages

由圖1 可知,3 個種質資源葉片的主要活性物質含量和活性變化趨勢基本一致。其中,總酚、總黃酮、Vc 含量和SOD 活性均呈先上升后下降的趨勢,依次表現為成熟葉＞幼葉＞老葉,總酚含量以無刺刺梨的成熟葉中為最高,3 個種質資源成熟葉中的總黃酮含量無顯著差異,Vc 含量以刺梨成熟葉中為最高,無刺刺梨和無籽刺梨成熟葉片中的SOD 活性無顯著差異;總三萜含量變化與上述4 種活性成分不同,呈持續上升趨勢,其中幼葉中總三萜含量最低,成熟葉中總三萜含量中等,老葉中含量最高,以刺梨老葉表現最為顯著。

2.2 葉片抗氧化活性分析

由圖2-A 可知,3 個種質資源在不同發育時期的刺梨葉片鐵離子還原能力(FRAP 值)均顯著高于沒食子酸和蘆丁,且均隨著刺梨葉片的發育FRAP 值呈先升高后降低的趨勢,依次表現為成熟葉＞幼葉＞老葉,成熟葉中,無籽刺梨的FRAP 值顯著高于其他2 種試驗材料,且分別是對照(沒食子酸和蘆丁)的4.38 倍和5.43 倍。

由圖2-B 可知,3 個種質資源在不同發育時期的葉片ABTS·清除能力均差異顯著(P＜0.05),且均顯著高于對照(沒食子酸和蘆丁)。其總體變化趨勢與FRAP 值一致,依次表現為成熟葉＞幼葉＞老葉,且成熟葉中,無刺刺梨ABTS·清除能力顯著高于其他2種試驗材料,分別是對照(沒食子酸和蘆丁)的9.77 倍和56.48 倍。

圖2 不同發育時期刺梨葉片的FRAP 值的變化和ABTS·、DPPH·清除能力Fig.2 Changes of FRAP value and ABTS·, DPPH·scavenging ability of leaves of rosa roxburghii at different developmental stages

由圖2-C 可知,與對照(沒食子酸和蘆丁)相比,3種材料在不同發育時期葉片DPPH·清除能力差異顯著(P ＜0.05),其DPPH·清除能力總體變化趨勢與FRAP 值和ABTS·清除能力基本一致,依次表現為成熟葉＞幼葉＞老葉,成熟葉中DPPH·清除能力則依次表現為刺梨＞無刺刺梨＞無籽刺梨,這3 種試驗材料的DPPH·清除能力分別是沒食子酸的9.75 倍、8.77 倍和8.21 倍,分別是蘆丁的21.59 倍、19.41 倍和18.17倍。

2.3 活性物質含量和抗氧化能力之間的相關性

由表1 可知,DPPH·清除能力和FRAP 值與總酚、總黃酮和Vc 含量均呈極顯著正相關(P ＜0.01),與SOD 活性均呈顯著正相關(P＜0.05);ABTS·清除能力與Vc 含量呈極顯著正相關(P＜0.01),與總酚和總黃酮含量呈顯著正相關(P＜0.05),與SOD 呈正相關,但不顯著。Vc 含量與DPPH·清除能力、ABTS·清除能力和FRAP 值均呈極顯著正相關(P＜0.01),總酚、總黃酮含量與DPPH·清除能力、ABTS·清除能力和FRAP值均呈顯著正相關(P＜0.05),說明Vc、總酚和總黃酮在刺梨葉片中抗氧化能力起關鍵性作用。而總三萜含量與DPPH·消除能力、ABTS·清除能力和FRAP 值均呈負相關,這可能與在葉片的整個發育時期總三萜含量呈上升趨勢,而DPPH·消除能力、ABTS·清除能力和FRAP 值均呈先升后降趨勢有關。

表1 活性物質與抗氧化能力的相關系數Table 1 Correlation coefficient between active substances and antioxidant capacity

2.4 5 種活性物質對抗氧化能力的貢獻

3 種刺梨葉片主要抗氧化物質,如總酚、總黃酮、Vc 含量和SOD 活性均以成熟葉中為最高,且3 種抗氧化能力也以成熟葉中最強,因此對成熟葉中具有抗氧化能力的5 種活性物質進行主成分分析。由表2 可知,各主成分特征值、貢獻率及累積貢獻率,取特征值大于1 的前2 個主成分,其累計貢獻率可達到75.138 3%,表明各性狀的貢獻率分散,累計貢獻率增長不明顯;而選擇前3 個因子,其累計貢獻率能達到91.862 2%,基本反映了5 個活性物質對抗氧能力貢獻的全部信息。主成分PC1、PC2、PC3 的貢獻率分別為46.512 8%、28.625 4%、16.723 9%。

表2 各性狀主成分的特征向量及貢獻率Table 2 Eigenvectors and percentages of accumulated contribution of principal components

原始變量和3 個主成分之間的相關性如表3 所示,PC1 中總酚和Vc 含量的系數較大,是對第一主成分影響最大的特征向量,說明PC1 是由總酚和Vc 含量組成的一個綜合指標。而PC2 主要代表性指標是總三萜含量和SOD 活性;PC3 主要代表性指標是總黃酮含量。5種活性物質對抗氧化能力貢獻依次表現為總酚、Vc 含量＞總三萜含量、SOD 活性＞總黃酮含量,其中以總酚和Vc 含量貢獻最大,總三萜含量和SOD 活性次之。

表3 刺梨葉片性狀變量因子負荷量Table 3 Foctor loadings for petals character variable of Rosa roxburghii

3 討論

本研究結果表明,3 種刺梨葉片中總酚含量均以生長60～65 d 的成熟葉最高,這與謝國芳等[20]的研究結果相同。無刺刺梨成熟葉中總酚含量明顯高于其他2 個刺梨材料,因此提取總酚時應以無刺刺梨成熟葉片為最佳原料。本研究中,3 種刺梨的成熟葉片中總黃酮含量均高于果實,但各材料間無明顯差異,其生長60～65 d 成熟葉片均較果實更適合于開發和提取總黃酮;總三萜含量則以刺梨老葉中最高,因此提取總三萜類物質可以選擇生長100 ～105 d 刺梨老葉;在3 種刺梨的成熟葉片中的Vc 含量和SOD 活性均明顯低于果實,因此對Vc 和SOD 方面的開發以果實為主。

研究表明,以植物為主的富含天然抗氧化劑的產品,可作為自由基清除劑,防止活性氧(reactive oxygen species,ROS)損傷健康細胞[32],用于治療包括糖尿病、癌癥、心血管疾病、神經退行性疾病和炎性疾病[33-35]。因此,開發天然抗氧化劑材料已成為一種趨勢。刺梨葉中含有豐富的活性物質,其中Vc 含量高于大部分果蔬產品,參與細胞內ROS 清除。貴州省果樹工程技術研究中心刺梨課題組前期研究發現刺梨葉片抗氧化能力是Vc 和SOD 協同作用的結果[8];刺梨葉醇提物與其對DPPH·和·OH 清除能力呈正相關[1]。本研究中,無籽刺梨葉提取物中總酚、總黃酮和Vc 含量與FRAP 和對ABTS·清除能力呈正相關,這與在木菠蘿、人心果和龍眼葉[36]及秀麗槭葉[37]中的研究結果一致。本研究還發現3 種刺梨葉片的3 種抗氧化活性均依次表現為成熟葉＞幼葉＞老葉,對不同基因型資源成熟葉來說,無刺刺梨對ABTS·清除能力、刺梨對DPPH·清除能力以及無籽刺梨FRAP 均不同程度高于其他2種刺梨材料。5 種活性物質的主成分分析表明,總酚和Vc 含量對抗氧化能力的貢獻率為46.512 8%;總三萜含量和SOD 活性的貢獻率為28.625 4%,總黃酮含量貢獻率為16.723 9%,說明刺梨葉片中5 種活性物質協同發揮抗氧化功能,而其中總酚和Vc 起著決定性作用。

總酚和總三萜類化合物是植物葉片的主要次生代謝產物,其藥用價值越來越受到人們重視。研究表明,酚類物質具有防治心腦血管疾病以及消炎、抗衰老等[38-39]。研究發現印檁葉多酚提取液的DPPH·和·OH 清除能力較Vc 強,能夠在較低質量濃度發揮抗氧化能力[40]。三萜類物質具有抗癌[41]、抗炎、抗菌、抗病毒、抗HIV、抗衰老、降低膽固醇等生理活性[42]。本研究中,3 個試驗材料成熟葉片中總酚含量明顯高于無刺和無籽刺梨果實,也顯著高于其他各時期葉片,對抗氧化能力的貢獻率為46.512 8%。本研究結果與前人研究[43]結果相似。費約果成熟葉中總酚含量明顯高于幼葉和老葉,具有極強的抗氧化活性[43]。因此,成熟葉片是提取天然成分尤其是多酚的主要來源,尤其以無刺刺梨成熟葉最佳。刺梨果實總三萜提取物對α-葡萄糖苷酶有較強的抑制作用,而刺梨老葉中總三萜含量高于刺梨果實[44],因此其開發的茶葉等產品可作為防治餐后高血糖癥及緩解高胰島素血癥的重要材料。

4 結論

刺梨及其2 個近緣種質葉內含有豐富的活性物質和較強的抗氧化能力,但不同基因型資源及其不同葉齡葉片在活性物質含量和自由基清除能力等方面存在差異。對不同葉齡葉片而言,成熟葉中總酚、總黃酮和Vc 含量最高,體外抗氧化能力最強,且前2 類主成分對抗氧化能力的累計貢獻率達到75%以上,發育時期較長的葉片中有較高的三萜類物質積累。綜上,3 個薔薇屬種質葉可作為天然抗氧化物質開發的良好材料來源。