溫度、pH、鹽度和碳氮源對嗜水氣單胞菌GZ1株生長的影響

潘吉脈 ，吳良濤 ，楊霞 ，程振濤 ,2,3，姜海波 ,2,3，文明 ,2,3

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動物生物制品工程技術中心，貴州 貴陽 550025；4.黔南民族職業技術學院現代山地農業工程系，貴州 都勻 558000）

嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila隸屬弧菌科、氣單胞菌屬，是一種革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛存在于淡水、污水、土壤及人體糞便中。魚感染該菌后鰓部、體表出血潰爛，內臟發白，可引起急性胃炎、腸炎等病癥，是一種典型“人-獸-魚”共患病原菌。近年來由嗜水氣單胞菌引發水生動物的病例不斷增多，是水生動物尤其是魚類最常見的致病菌[1]。該菌嚴重威脅水產養殖業的發展和人類健康[2]。研究表明，選擇具有代表性的免疫原性好的嗜水氣單胞菌菌株，制備滅活疫苗，用于魚類浸泡或注射免疫，在魚類嗜水氣單胞菌病防控上取得了良好效果[3,4]。在規模化生產菌體過程中，細菌的數量和致病力受溫度、鹽度、pH、碳源、氮源等培養條件的影響[5]。本試驗通過研究不同培養條件下嗜水氣單胞菌的生長，優化工業化生產嗜水氣單胞菌的培養條件，以期為嗜水氣單胞菌工業化生產該菌滅活疫苗及防控魚類嗜水氣單胞菌病提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌GZ1株由貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室保存。

胰蛋白胨、酵母粉與瓊脂糖均購自上海博微生物科技有限公司；NaCl購自重慶川江化學試劑公司；HCl（分析純度38%）和NaOH（分析純度32%），均購自杭州聯科生物有限公司；可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、硫酸鎂等均購自上成都市科龍化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養方法

將菌株劃線接種在以胰蛋白胨為氮源、酵母粉為碳源的LB固體培養基上，37℃恒溫培養24h，挑取單個菌落，接種LB液體培養基，30℃搖床振蕩培養 24h，8000r/min，離心 5min，取菌體，用無菌 PBS洗滌3次，取沉淀，配制成濃度為1×108cfu/mL菌懸液，4℃保藏備用。

1.2.2 不同培養條件對嗜水氣單胞菌GZ1株生長狀況的影響

取培養24h菌液，8000r/min離心5min，取菌體，無菌PBS洗滌3次，取菌懸液0.5mL，加PBS至5mL，倍比稀釋，用平板計數法測定菌液細菌含量，以無菌PBS為對照，以菌液細菌含量為Y軸，菌液OD600為X軸，構建回歸方程。

生長曲線的測定：將上述菌液接種于LB液體培養基，30℃搖床振蕩（180r/min）培養，用分光光度計測定培養第 2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、18℃、24℃、36℃、48h 菌液 OD600[6]，用回歸方程公式計算細菌濃度，以培養時間為橫坐標，細菌濃度為縱坐標，繪制嗜水氣單胞菌生長曲線。

溫度：培養溫度分別設為 4℃、25℃、28℃、30℃和37℃，方法同1.2.2，24h時以無菌LB液體培養基為對照，每個處理設3個重復，比較溫度對GZ1株生長的影響。

pH：用NaOH和HCl調節培養基pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，每個處理設3個重復，24h時以無菌LB液體培養基為對照，比較pH對GZ1株的影響。

NaCl濃度：分別調制0%、1%、2%、3%、4%和5%NaCl的LB液體培養基，加入1%對數期GZ1株菌液，30℃、180 r/min振蕩培養24h，以無菌LB液體培養基為對照，每個處理設3個重復，比較NaCl濃度對GZ1株生長的影響。

Mg2+濃度：添加硫酸鎂，調制Mg2+濃度分別為1mg/L、2.5mg/L、5mg/L和 10 mg/L的 LB培養基，培養24h時以無菌LB液體培養基為對照，每個處理設3個重復，比較Mg2+濃度對GZ1株生長的影響。

碳源：用可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸、碳酸鈉配制成碳濃度為0.42 g/L的不同碳源培養基，培養24h時以無菌LB液體培養基為對照，每個處理設3個重復，比較碳源對GZ1株生長的影響。

氮源：用氯化銨、硫酸銨、尿素、蛋白胨、酵母粉配制成氮濃度為0.71g/L的不同氮源培養基，加入1%對數期GZ1株菌液30℃、180 r/min振蕩培養24h，無菌LB液體培養基為對照，每個處理設3個重復，比較氮源對GZ1株生長的影響。

1.2.3 正交試驗設計

在單因素對嗜水氣單胞菌GZ1株生長影響的基礎上，取溫度、pH、NaCl濃度、Mg2+濃度4個因素作為考察因素，每個因素設3個水平，以細菌濃度為指標，設計正交試驗表1。

表1 正交試驗設計表Tab.1 An orthogonal test design table

1.2.4 數據處理

結果以平均數和標準偏差表示（x±s），用excel、SPSS19.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌GZ1株的濃度與OD600的線性方程與生長曲線

細菌含量與OD600成線性關系（圖1），其回歸方程為：Y=17.65X+0.43，Y 為細菌含量 （×108cfu·mL-1），X 為 OD600。

圖1 嗜水氣單胞菌GZ1株的濃度與OD600的線性方程Fig.1 The linear equation between density of A.hydrophila GZ1 strain and OD600value

由圖2可知，在30℃時，前12h為該菌生長延遲期，12～24h 為生長對數期，24～36h 為生長穩定期，36 h后進入衰亡期。

圖2 嗜水氣單胞菌GZ1株生長曲線Fig.2 Growth curve of GZ1 strain of A.hydrophila

2.2 不同培養條件對嗜水氣單胞菌GZ1株生長的影響

2.2.1 溫度對GZ1株生長的影響

由圖3可知，除28℃與30℃兩組外，其他各溫度組間GZ1株生長差異顯著（P＜0.05），4℃時GZ1株幾乎不生長，在25～37℃生長良好，菌液濃度較高，而在25℃時生長最好，菌液濃度最高，達到18.73×108cfu/mL。

圖3 溫度對嗜水氣單胞菌GZ1株生長的影響Fig.3 Effect of temperature on growth of A.hydrophila GZ1 strain

2.2.2 pH對GZ1株生長的影響

由圖4可知，pH在5.5～8.0之間對GZ1株生長影響不同，在pH6.0、7.0 間生長差異不顯著（P＞0.05），其他pH生長差異顯著（P＜0.05），pH6.5時菌液濃度最高（20.11×108cfu/mL），pH8.0時菌液濃度最低（10.60×108cfu/mL）。

圖4 pH對嗜水氣單胞菌GZ1株生長的影響Fig.4 Effect of pH on growth of A.hydrophila GZ1 strain

2.2.3 NaCl濃度對GZ1株生長的影響

由圖5可知，NaCL濃度為0%～5%對GZ1株生長的影響差異顯著（P＜0.05），NaCL濃度為0%和5%時，該菌幾乎不生長，而NaCl濃度為2%時，細菌生長最好，菌液濃度最高，為31.61×108cfu/mL。

圖5 NaCL濃度對嗜水氣單胞菌GZ1株的影響Fig.5 Effect of NaCL concentration on growth of A.hydrophila GZ1 strain

2.2.4 Mg2+對GZ1株生長的影響

由圖6可知，不同濃度Mg2+對GZ1株生長影響差異顯著（P＜0.05），Mg2+濃度為 2.5 mg/L時,細菌濃度最高,為 30.43×108cfu/mL，Mg2+濃度過高，細菌濃度反而降低，說明細菌濃度不隨Mg2+濃度高而增加。

圖6 Mg2+濃度對嗜水氣單胞菌GZ1株生長的影響Fig.6 Effect of Mg2+concentration on growth of A.hydrophila GZ1 strain

2.2.5 碳源對GZ1株生長的影響

由表2可知，碳源影響GZ1株的生長，以碳酸鈉和檸檬酸為碳源時，幾乎不生長，菌液濃度最低，僅為0.52×108cfu/mL左右，而碳源為蔗糖時，菌液濃度最高（9.85×108cfu/mL），說明蔗糖適合作為該菌碳源。

表2 碳源對嗜水氣單胞菌生長的影響Tab.2 Effect of carbon source on A.hydrophila

2.2.6 氮源對GZ1株生長的影響

由表3可知，以蛋白胨和胰蛋白胨為氮源時，GZ1株生長良好，氮源為蛋白胨時，菌液濃度最高，而氮源為尿素和氯化銨時，GZ1株幾乎不生長，這說明氮源影響GZ1株的生長。

表3 氮源對嗜水氣單胞菌生長的影響Tab.3 Effect of nitrogen source on growth of A.hydrophila

2.2.7 正交試驗結果

由表4可知，4個考察因素中，溫度對該菌生長影響最大，Mg2+濃度次之，pH影響最小，最優組合是A2B2C2D2，即 25℃、pH 6.5、2%的 NaCl和 2.5mg/L 的Mg2+。

表4 正交實驗結果Tab.4 Orthogonal experiment results

3 討論

嗜水氣單胞菌可引起多種動物敗血癥，特別是水產養殖動物。用抗生素藥物防治嗜水氣單胞菌病易產生耐藥性，疫苗免疫是防控嗜水氣單胞菌病的主要手段，而要獲得免疫原性好的嗜水氣單胞菌，在大規模生產菌體過程中須充分利用其生長繁殖規律。研究表明，處于對數增長期的細菌酶活性高、繁殖率高和致病性強[7]，而被用于滅活疫苗的研發。

本研究采用分光光度計測定不同培養條件下嗜水氣單胞菌菌液的OD，探究不同培養條件對嗜水氣單胞菌GZ1株生長的影響。結果顯示，GZ1株的最適合生長溫度為25℃，這與Miyata等的報道一致，但與Huys等[8-12]報道不一致，這可能是由于各地菌株存在著差異，因而生理生化試驗結果也存在著差異。pH影響細菌，改變細胞膜上的電荷，從而影響細菌對營養物質的吸收和酶活性[13]；多數病原菌的最適合pH為中性或弱堿性環境中生長，本次研究結果顯示：該菌的最適生長pH為6.5的弱酸性環境。有資料顯示：初始pH為7.0的培養基，接種嗜水氣單胞菌培養后，再測發現培養基pH降低，提示嗜水氣單胞菌生長繁殖可以產酸；于華[14]等研究發現：產酸芽孢桿菌的最適生長pH為5.5，孫鵬飛[15]等研究表明：食竇魏氏菌Weisella cibaria、巴氏醋酸桿菌Acetobacter pasteurianus最適培養pH分別為6.5與6.0。本研究顯示嗜水氣單胞菌GZ1株的最適生長pH為6.5的弱酸性環境，可能是產酸菌最適酸性環境中生長，與自身產酸存在一定關系。NaCl的濃度通過滲透壓來影響細菌的生長繁殖。本研究發現，該菌的最適生長繁殖NaCl濃度為2%，NaCl濃度為0%和5%時，細菌幾乎不生長，可能是培養基中的滲透壓比菌體內滲透壓過低或過高所致。

細菌的生長繁殖需要碳源、氮源、無機鹽、水和生長因子。在LB液體培養基中，酵母粉是細菌的主要碳源，為細菌提供能量；胰蛋白胨是主要氮源，為細菌提供合成蛋白質與核酸的原料。不同碳源、氮源的結構不同，被細菌的利用程度與代謝方式也不一樣[16]。本次研究中，蔗糖作為嗜水氣單胞菌唯一碳源時，細菌濃度最高，為該菌培養條件的優化提供參考。蛋白胨為嗜水氣單胞菌唯一氮源時，細菌濃度最高，蛋白胨促進嗜水氣單胞菌的生長繁殖；但氯化氨、硫酸氨和尿素為氮源時，細菌幾乎不生長即細菌含量較低，這可能是這三種氮源抑制了嗜水氣單胞菌的生長，其抑制機制需進一步研究。

本試驗采用正交設計與單因素方法相結合，篩選出不同培養條件對嗜水氣單胞菌GZ1株生長狀況的最優組合，使試驗結果更科學、更完善[17]。