舌鱗狀細胞癌中Bmi-1和P16的表達及對癌細胞侵襲的調控作用

李斌 王芳 李詠 蔡揚

舌鱗狀細胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)具有較高的侵襲力和早期淋巴結轉移的特點，盡管目前治療TSCC方面的診療技術在不斷的提高，但是TSCC患者的預后仍然不佳，究其原因與TSCC的區域性和遠處淋巴轉移密切相關[1]。B細胞淋巴瘤濾過性病毒插入位點1(B cell-specific moloney leukemia virus insert site-1，Bmi-1)目前已經被證實屬于致癌基因，其在腫瘤的發展過程著扮演著重要角色，Bmi-1的高表達與人類多種腫瘤如胰腺癌、乳腺癌等的預后不良有關[2-3]，此外，Bmi-1還可以促進黑色素瘤上皮間質轉化的發生，促進腫瘤的侵襲和遷移[4]，但目前關于Bmi-1在TSCC中的表達及調控TSCC侵襲的作用及機制報道不多，本研究綜合TSCC臨床病理及細胞研究，探討Bmi-1在TSCC侵襲過程中的作用及可能機制，為TSCC的臨床治療研究提供可能靶點。

1 材料與方法

1.1 病理標本

本實驗所需53 例TSCC石蠟標本均來自于貴州醫科大學附屬醫院口腔診療中心，所有TSCC標本均為腫瘤原發灶，其中高分化33 例、中低分化20 例，其中有淋巴結轉移組34 例、無淋巴結轉移組19 例。Ⅰ～Ⅱ期12 例，Ⅲ～Ⅳ期41 例。本研究由貴州醫科大學附屬醫院倫理審查委員會批準。

1.2 細胞系

舌鱗癌細胞株(CAL27)由上海交通大學醫學院第九人民醫院口腔醫學重點實驗室惠贈。

1.3 試劑

兔抗人Bmi-1多克隆抗體(Santa Cruz，美國)；MMP9單克隆抗體(CST，美國)；SP免疫組化試劑盒及DAB染色試劑盒(中杉金橋)；GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、鼠抗人P16單克隆抗體(福州邁新)；Bmi-1抑制劑PTC-209(Selleck，美國)；Traswell小室等(Coring，美國)；本實驗余所用實驗儀器均由湖南醫藥學院生物研究中心提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 免疫組化 嚴格按照SP免疫組化試劑盒說明書操作，同時設置陽性和陰性對照組，工作濃度Bmi-1(1∶150)，p16(1∶50)。評價標準[5]：Bmi-1陽性為TSCC細胞核染棕黃色或者棕褐色顆粒，胞漿也可有少量棕黃色樣顆粒，P16陽性為TSCC細胞核染棕黃色樣顆粒，胞質中也可有淡黃染色。最后結果判定用染色強度和染色百分比進行評估：染色強度：陰性染色1分，弱染色2分，中等強度染色3分，強染色4分；染色百分比：陽性細胞百分率≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分；根據染色強度和百分比的乘積判定結果，分數≤4分為(-)，5分以上為(+)。上述結果至少由兩位病理科醫生在雙盲情況下觀察所判定。

1.4.2 細胞培養 TSCC細胞(CAL27)接種于含12% FBS的DMEM/F12培養基中，培養條件為37 ℃，5%CO2的培養箱中培養。

1.4.3 Transwell實驗檢測 Matrigel基質膠與無血清培養基按照1∶5配比，然后取60 μl均勻鋪于Transwell小室的上室中，計數細胞調整細胞密度約為4×108個/L，上室加入終濃度為10 μmpl/L的抑制劑PTC-209處理TSCC細胞，小室下室加入含10% FBS的培養基，24 h后無菌棉簽拭去上室多余細胞和基質膠，PBS沖洗，再甲醛固定，0.1%結晶紫染色，于倒置相差顯微鏡下取4 個視野拍照并計算細胞數目。

1.4.4 蛋白質印跡法檢測 Bmi-1抑制劑PTC-209處理后相關蛋白表達的影響 應用10 μmol/L Bmi-1抑制劑PTC-209處理TSCC細胞24 h后，收集細胞，冰上裂解，提取細胞總蛋白。經蛋白濃度定量及水浴變性后行SDS電泳分離蛋白，PVDF膜濕轉后，5% BSA封閉2 h，再加入Bmi-1(1∶1 000)、P16(1∶500)、MMP9(1∶1 000)一抗4 ℃恒溫冰箱過夜，次日用二抗孵育1 h，化學發光法顯影，儀器掃描記錄。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 Bmi-1、P16在TSCC組織中的表達

檢測結果如圖 1、表 1。53 例TSCC病理組織切片中，Bmi-1(+)有34 例(64.15%)，Bmi-1染色強度與臨床分期(P<0.05)和淋巴結轉移(P<0.05)相關，與分化程度無關(P>0.05)，P16(+)有25 例(47.17%)，P16染色強度與臨床分期(P<0.05)和淋巴結轉移(P<0.05)相關，與分化程度無關(P>0.05)。

2.2 Bmi-1/P16表達與TSCC臨床病理因素的相關性

如表 2所示：在53例TSCC病理切片中，Bmi-1表達陽性合并P16表達陰性的TSCC病理組織染色強度與臨床分期(P<0.05)和淋巴結轉移(P<0.05)相關，而與分化程度無關(P>0.05)，表 3中再通過Spearman法分析二者相關性顯示Bmi-1與P16的表達具有負相關性(r=-0.555，P<0.05)。

2.3 PTC-209對TSCC細胞侵襲能力的影響

如圖 2所示：應用抑制劑PTC-209處理TSCC細胞24 h后，與空白對照組比較，抑制劑處理組舌鱗癌細胞的侵襲能力明顯降低(P<0.001)，提示抑制Bmi-1的表達能降低舌鱗癌細胞的侵襲能力。

2.4 PTC-209處理TSCC細胞Bmi-1、P16及MMP9蛋白表達的影響

應用Bmi-1抑制劑PTC-209處理TSCC細胞后，Bmi-1蛋白表達下調(P<0.001)，P16蛋白表達升高(P<0.001)，MMP9表達被抑制(P<0.01)(圖 3)。

表 1 Bmi-1、P16的表達與臨床病理因素間的關系

注： ①P<0.05

圖 1 Bmi-1與P16在TSCC組織中表達情況 (SP， ×400)

Fig 1 Bmi-1 and P16 expression in tongue squamous cell carcinoma (SP， ×400)

表 2 Bmi-1/P16表達與TSCC臨床病理因素的關系

Tab 2 Relationship between co-expression of Bmi-1 and P16 and clinicopathological factors

臨床病理因素nBmi-1(+)/P16(-)χ2P值組織學分級 高分化33140.7900.374中/低分化2011淋巴結轉移 無1948.1070.004①有3421臨床分期 Ⅰ/Ⅱ1219.3890.002①Ⅲ/Ⅳ4124

注： ①P<0.05

表 3 TSCC中Bmi-1與P16表達的相關性

Tab 3 Analysis of the correlation between Bmi-1 and P16 expression in TSCC

Bmi-1(-)(+)r值P值P16(-)325-0.5550.000①P16(+)169

3 討 論

Bmi-1基因是屬于PCG(polycomb-group)家族的重要成員之一，在腫瘤的發生、發展過程中扮演著重要角色，廣泛參與多種腫瘤的增殖，干細胞的自我更新等活動[6-7]。目前已經被證實，在乳腺癌、胰腺癌等腫瘤

圖 2 TSCC細胞中Bmi-1表達對細胞侵襲能力的影響 (×100)

Fig 2 The effect of Bmi-1 on the ivasion of TSCC cells (×100)

圖 3 抑制劑PTC-209對Bmi-1、P16和MMP9表達影響

Fig 3 The effect of inhibitor PTC-209 on the expression of Bmi-1, P16 and MMP9

中Bmi-1往往處于高表達水平，通過RNA干擾技術沉默Bmi-1，可以降低腫瘤的惡性生物學行為，達到抑制腫瘤的作用[4,6]。目前關于Bmi-1的表達與腫瘤臨床病理因素的關系報道有差異，Vonlanthen等[8]研究非小細胞肺癌的患者時發現，有58%病理組織中Bmi-1的高表達與腫瘤的分化程度、組織學分類以及患者預后無關；而Bmi-1在胃腸道間質瘤中高表達，與胃腸道間質瘤的淋巴結轉移、臨床分期有關患者5 年生存率等相關[9]。本實驗在研究TSCC時亦發現，Bmi-1的高表達與TSCC的淋巴結轉移及臨床分期相關，與分化程度無關。P16蛋白是一種細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制物，在淋巴瘤等等都有檢測到P16表達突變或者缺失，進而誘導腫瘤細胞周期調節失控，導致細胞的異常增生[10]。P16在腫瘤組織中的表達豐度，可以作為宮頸癌，胰腺癌癌前病變或癌變的重要指標，為患者的預后提供參考[11]。本研究中，應用免疫組化法染色TSCC組織發現，P16的低表達(或失表達)與TSCC的淋巴結轉移及臨床分期相關，與分化程度無關。

關于Bmi-1與P16的關系，Wang等[9]研究胃腸道間質瘤時發現組織中Bmi-1高表達的同時也可伴有P16的低表達，且相關性分析顯示二者呈負相關性，而本實驗也有類似的發現，同時還發現Bmi-1表達陽性合并P16表達陰性的舌鱗癌組織中，有淋巴結轉移組較無淋巴結轉移組高，同樣地臨床分期Ⅲ/Ⅳ組較Ⅰ/Ⅱ組高，這提示Bmi-1和P16可能共同參與了舌鱗癌的侵襲和轉移過程，二者可能具有疊加效益。

Bmi-1的高表達作為腫瘤惡性程度的重要指標，其廣泛參與腫瘤的增殖，干細胞的自我更新，甚至參與腫瘤細胞的上皮間質轉化進程，促進腫瘤的侵襲[6]。前面免疫組化發現P16的失表達與TSCC的淋巴結轉移相關，而上調P16的表達，可以抑制肝細胞癌的侵襲能力；Bmi-1作為P16的上游基因，其可以通過抑制P16的表達促進腫瘤的發展，這些都提示，在腫瘤侵襲甚至發生淋巴結轉移的過程中Bmi-1和P16均有參與。MMP9是基質金屬蛋白酶家族主要成員之一，其可以降解腫瘤基底膜的主要成分(IV型膠原蛋白)，并在腫瘤血管化、侵襲以及轉移的過程中發揮著主要的作用[12]。本研究為證明Bmi-1對舌鱗癌侵襲的作用，再以舌鱗癌細胞株為研究對象，應用Bmi-1抑制劑處理舌鱗癌細胞24 h后發現，舌鱗癌細胞的侵襲能力顯著降低，這表明Bmi-1的表達能促進舌鱗癌細胞的侵襲，進而影響舌鱗癌的淋巴結轉移和臨床分期等。為進一步探討其可能作用機制，實驗應用蛋白印記法檢測抑制劑PTC-209處理細胞后相關蛋白表達變化，舌鱗癌細胞Bmi-1表達下降，P16表達上調，此外MMP9表達抑制，而這表明Bmi-1可通過抑制P16蛋白或上調MMP9蛋白，從而促進舌鱗癌細胞的侵襲。

綜上所述，Bmi-1的表達與舌鱗癌的淋巴結轉移及臨床分期密切相關，Bmi-1和P16在TSCC中的表達異常，可能共同參與了舌鱗癌的侵襲過程，Bmi-1可通過下調P16，上調MMP9促進舌鱗癌的侵襲。