轉化生長因子β3促進兔牙髓干細胞成骨向分化的體外實驗研究

艾力麥爾旦·艾尼瓦爾 張曉莉 卡米力江·買買提明 日孜瓦古力·阿木提 木合塔爾·霍加

牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是外胚間充質來源的具有多向分化潛能的成體干細胞[1]，隨著組織工程技術的日益發展，其在各類支架材料和生長因子誘導下成骨向分化相關的研究愈來愈深入。轉化生長因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)是具有多重效能的生長因子超家族，參與調控機體胚胎發育、組織再生和免疫系統等眾多方面[2]。TGF-β3 作為TGF-β超家族的一員,在細胞增殖、分化、信息傳遞、代謝和凋亡的調節中起重要作用，是組織工程研究中比較理想的細胞因子[3]。本課題組前期研究已證實TGF-β3對體外培養的兔牙髓干細胞(rabbit dental pulp stem cells,rDPSCs)增殖無影響但對其成骨向分化能力有一定促進作用，并在20～100 ng/ml范圍內呈濃度依賴關系,以80 ng/ml效果最佳[4]。本實驗探討用80 ng/ml TGF-β3誘導rDPSCs，并將其成骨作用與礦化液(含10%FBS, l%雙抗的DMEM高糖培養液中加入10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 nmol/L地塞米松、50 mg/L抗壞血酸)和常規培養的rDPSCs做對比研究，探討rDPSCs體外在TGF-β3作用下成骨向分化的效果及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

健康新西蘭幼兔3 只，3～4 周齡，體重1.5～2.0 kg,雌雄不限(由新疆醫科大學實驗動物中心提供)。胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青鏈霉素、胰蛋白酶、高糖DMEM培養基 (Hyclone，美國)；TGF-β3(Peprotech,美國)；堿性磷酸酶(ALP)染色液(北京索萊寶)；OCN一抗(Abcam,美國)；COL-I一抗(Novus Biologicals,美國)；Runx-2一抗(北京博奧森)；茜素紅S、L一抗壞血酸(Sigma，美國)；β一甘油酸磷酸鈉、地塞米松(武漢博士德)山羊抗兔二步法檢測試劑盒(北京中衫金橋)；實時熒光定量PCR儀(RT-qPCR)(Bio-Rad，美國)；倒置顯微鏡(Leica，德國)。

1.2 rDPSCs分離及培養

鹽酸利多卡因快速過量注射兔耳緣靜脈將其處死，無菌條件下取上下頜骨置于預冷的高倍雙抗中侵泡20 min，移置于培養皿中PBS沖洗3 次，剪除頜骨分離牙齒并剪掉根尖處1 mm牙體組織，拔髓針拔出牙髓，參照本課題組前期實驗方法[5-6]，酶解組織塊法分離培養原代rDPSCs,每2～3 d換液1 次，待細胞長滿培養皿80%～90%后0.25%胰酶消化傳代培養。

1.3 免疫細胞化學染色

取生長狀態良好的第三代rDPSCs，6×103/L細胞濃度接種于24 孔板中，分組培養第3、5、7、14 d各取1 塊培養板，4%多聚甲醛固定50 min，PBS洗3 次，5%進口羊血清封閉30 min，滴加一抗 (稀釋比例分別為OCN 1∶1 000,COL-I 1∶300，Runx-2 1∶400)4 ℃孵育過夜(至少16 h),PBS洗3 次，滴加二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗3 次，DAB顯色，蘇木素復染，倒置顯微鏡下觀察并拍照，每組實驗重復3 次。胞質內出現棕黃色顆粒為陽性結果，顏色越深表明陽性程度越強。

1.4 RT-qPCR

取第三代細胞1×106個/孔接種于6 孔板中分組培養，培養第7、14天，用Trizol法提取細胞mRNA，第一鏈cDNA逆轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA模板，以β-actin為內參對照。引物由廣州天一輝遠公司設計合成(引物序列見表 1)，PCR反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s，40循環。最終數據以2-△△Ct進行分析，Graphpad 7.0軟件繪圖。

表 1 本研究中PCR基因引物序列

1.5 茜素紅染色

取第三代rDPSCs，以2×106/孔濃度接種于六孔板，待細胞貼壁隨機分為3 組開始實驗，第7、14、21天各組取一塊培養板棄培養液，PBS沖洗后用4%多聚甲醛室溫細胞固定50 min，PBS洗3 次，現配的1%茜素紅染液1 ml室溫孵育30 min后蒸餾水輕輕沖洗表面的染液，自然干燥，鏡下觀察礦化結節并拍照，在50 倍鏡下，每個孔隨機選取中段5 個視野計算其礦化結節數量并分析各組之間的差異。

1.6 統計學分析

圖 1 原代培養3 d的rDPSCs(倒置顯微鏡， ×50)

Fig 1 Primarly cultured rDPSCs for 3 days (Inverted Microscope, ×50)

2 結 果

2.1 rDPSCs形態學觀察

酶解組織塊法成功分離獲得rDPSCs,48 h即可見組織塊周圍爬出來的原代細胞(圖 1A)，細胞貼壁生長，形態多呈梭形和紡錘形，少數呈三角形、多角形。約6～8 d匯合達到80%～90%，進行首次傳代，隨培養時間和代數增加細胞形態單一呈長梭形(圖 1B)。

2.2 免疫細胞化學染色結果

實驗組3 d出現COL-I強陽性，Runx-2第7天出現強陽性，OCN第7天出現弱陽性，第14天強陽性；對照組7 d出現COL-I陽性,第7天Runx-2弱陽性，第14天Runx-2強陽性、OCN弱陽性；空白組第7天出現COL-I弱陽性，14 d Runx-2弱陽性，OCN為陰性(圖 2)。

2.3 RT-qPCR結果

RT-qPCR結果顯示(圖 3)，各組培養第7天在實驗組中ALP、COL-I、Runx-2基因的表達量均高于空白組(其中ALP、COL-IP<0.01，Runx-2P<0.05)ALP，COL-I基因表達量高于對照組(COL-IP<0.01，ALPP<0.05)；培養14 d，實驗組ALP、COL-I、Runx-2、OCN基因表達均高于空白組(P<0.01)，另外，實驗組ALP、COL-I基因的表達高于對照組(P<0.05)。

圖 2 rDPSCs的COL-I免疫細胞化學染色結果 (×200)

Fig 2 Immunohistochemical staining for COL-I expression of rDPSCs (×200)

圖 3 rDPSCs中ALP、COL-I、Runx-2、OCN基因表達情況

2.4 茜素紅染色結果

實驗組培養第7天細胞排列呈簇狀聚集；培養14 d，實驗組出現細胞匯合并且細胞排列呈以礦化結節為中心的火山口樣、漩渦狀，有的呈長線形排列，局部聚集成灶，肉眼觀察可見白色結節，茜素紅染色即可見多個大小不等的礦化結節，其余兩組均無結節。培養21 d,實驗組、對照組及空白組均出現礦化結節，實驗組礦化結多且明顯(圖 4)。礦化結節數分別為實驗組2.20±0.83,對照組1.20±0.45，空白組0.40±0.54，實驗組與其余2 組均有統計學差異(P<0.05)。

圖 4 rDPSCs茜素紅染色 (×50)

Fig 4 ARS staining of rDPSCs (×50)

3 討 論

創傷、腫瘤、炎癥以及牙源性、牙周源性疾病引起的頜面部骨缺損的修復是骨組織工程面臨的重要問題。臨床上常用的頜面部修復方法主要是自體骨和異體骨移植修復，其中自體骨移植修復被公認為是金標準，但其有自身的缺點如有限的骨組織量，手術引起的痛苦，免疫問題如炎癥和骨吸收等。所以在最短的時間內盡可能全面地修復骨缺損仍然是目前骨組織工程的研究熱點。已有研究證實DPSCs相比骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)具有更好的克隆形成能力、增殖能力和成骨向分化能力[7-8]，而且DPSCs由顱神經嵴來源的外胚間充質發育而成，與顱頜面骨及牙周組織具有相同的組織來源，因此選取DPSCs作為顱頜面骨缺損修復較骨髓基質干細胞具有更豐富的分化潛能和同源優越性。

目前哺乳類動物已發現3 個TGF-β亞型，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β3作為較新被發現的TGF-β亞型，其在軟骨發生和軟骨再生中的重要調節作用相關研究最為成熟[9]。TGF-β3具有抗纖維化作用，能夠促進創傷愈合和瘢痕形，參與組織修復的多重過程[10]。Hara等[11]證實2 μg/ml的醋酸氟輕松(FA)和5 ng/ml 濃度的TGF-β3聯合人骨髓間充質細胞能促進小鼠的膝關節軟骨缺損模型中缺損部位的軟骨再生。最近有學者證明了TGF-β3對干細胞成骨向分化和成牙本質向分化過程中的協助作用。Deng等[12]發現25 ng/ml的TGF-β3能夠誘導人骨髓間充質干細胞(hBMMSCs)通過激活TGF-β信號通路向成骨向分化從而刺激骨再生。Huojia等[13]證實TGF-β3在10～100 ng/μl范圍內能夠以劑量依賴的方式促進DPSCs的異位礦化、促進DPSCs成牙本質向分化。但TGF-β3在DPSCs成骨分化和骨形成過程中的作用和機制尚不清楚。通過本研究，證實了TGF-β3體外通過上調成骨標志基因的表達來促進rDPSCs的成骨向分化。

鑒定成骨形成的經典標準有高表達ALP，合成COL-I、形成OCN等骨基質蛋白、體外形成礦化結節。成骨細胞膜表面表達高強度的ALP，是成骨細胞分化的早期指標。COL-I是骨基質的重要組成部分，也是成骨細胞重要的特異性基因。OCN在成骨細胞分化晚期開始活躍，其表達升高說明成骨細胞開始進入礦化期[14-15]。Runx-2又稱核心結合因子Cbfα1，是成骨分化和骨形成過程中的重要調節因子，出現在成骨分化的早期，可激活、啟動下游包括 ALP、OCN和COL-I等基因的轉錄和表達,在尚未成熟的成骨細胞中表達最高而隨著成骨細胞的成熟其表達下降[15-16]。本實驗以ALP、COL-I、OCN、Runx-2為檢測指標，RT-qPCR結果顯示實驗組ALP水平明顯高于其余兩組并第7天表達量最高，表明實驗組成骨向分化水平一周左右就達到峰值。免疫細胞化學結果顯示實驗組COL-I，Runx-2，OCN表達的時間早且均強于其余兩組。ALP、COL-I、Runx-2及OCN基因含量均高于對照組，說明TGF-β3誘導rDPSCs通過上調ALP、COL-I、OCN、Runx-2等的表達從而加速其成骨向分化，效果優于礦化液誘導組。成骨向分化的最終環節是細胞外基質礦化，實驗組誘導第14天即出現明顯的礦化結節，表明TGF-β3誘導組具有比其余兩組更強的體外礦化能力。

綜上，通過本研究證實80 ng/ml TGF-β3體外能夠促進rDPSC向成骨向分化，有效縮短其成骨時間，為將其運用到頜面部及種植體周圍骨缺損的修復及組織工程提供了一定的依據和新的視角。