黃酮抗金黃色葡萄球菌感染靶點(diǎn)SrtA的活性研究

林 銳

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，江蘇鹽城 224000）

1 前言

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），也稱“金葡菌”，是常見的革蘭氏陽性菌，具有較強(qiáng)的致病力，可引起多種嚴(yán)重感染。最常見的金黃色葡萄球菌引發(fā)的感染是局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心臟內(nèi)膜炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。流行病學(xué)資料顯示，革蘭氏陽性菌感染中金黃色葡萄球菌發(fā)病率位居首位，是燒傷創(chuàng)面感染、急性肝功能衰竭等疾病的重要病原菌。

感染金黃色葡萄球菌，通常可選用紅霉素、新型青霉素、慶大霉素、萬古霉素或先鋒霉素Ⅵ治療，但由于抗生素的濫用，出現(xiàn)多種耐受抗生素的新菌株。1961年臨床上首次分離出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（mythically-resistant staphylococcus aureus，MRSA），該菌對(duì)所有內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，并對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等抗菌藥物多數(shù)耐藥，可以抵抗強(qiáng)力的抗生素和藥物，并能夠引起各種感染，因此也被稱為“超級(jí)細(xì)菌”（Superbug）。細(xì)菌的耐藥問題使得可用的藥物也越來越少，對(duì)于高耐藥和多藥耐藥的MRSA，萬古霉素、替考拉寧或利奈唑胺成為最后的救命藥物。但其他國家已報(bào)道有耐萬古霉素金黃色葡萄球菌（vancomycin-resistant staphylococcus aureus，VRSA） 檢出，利奈唑胺耐藥的菌株亦有報(bào)道。

面對(duì)嚴(yán)峻的抗菌藥物用藥形勢(shì)，如何減少耐藥菌株的生成和研制新的抗菌藥物已是醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)議題。在尋找新型結(jié)構(gòu)的藥物替代現(xiàn)有抗生素的過程中，研究者會(huì)考慮幾方面的問題。一方面，隨著傳統(tǒng)的微生物來源的抗生素或其衍生物逐漸失效，植物來源以及天然產(chǎn)物來源的抗生素不失為更好的選擇。另一方面，病原菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥機(jī)制促使我們需要發(fā)掘抗生素殺滅或抑制病原菌的新靶標(biāo)，去避免新的藥物在短時(shí)間臨床使用中也造成耐藥性的情況。

革蘭氏陽性菌的表面蛋白與其致病性密切相關(guān)，其表面蛋白是在細(xì)胞質(zhì)中合成，通過Sortase的轉(zhuǎn)肽作用進(jìn)而錨定到菌體細(xì)胞壁肽聚糖上[6]。Comfort，Dramsi等對(duì)892種表面蛋白的分選信號(hào)進(jìn)行了分析，根據(jù)Sortase所識(shí)別的分選信號(hào)的不同，將Sortase分為A、B、C、D共4類，分別以SrtA，SrtB，SrtC，SrtD加以表示。SrtA識(shí)別LPXTG 基序，主要介導(dǎo)與黏附相關(guān)的表面蛋白的錨定，是最典型的家族蛋白。

SrtA是一種膜結(jié)合巰基轉(zhuǎn)肽酶，由206個(gè)氨基酸組成，它的N端部份是一個(gè)跨膜區(qū)，C端部份則是一個(gè)催化區(qū)域。SrtA能識(shí)別表面蛋白C端所含的保守氨基酸序LPXTG（X指任意的氨基酸），并裂解蘇氨酸（T）和甘氨酸（G）間的肽鍵，產(chǎn)生一個(gè)蘇氨酸的羰基末端，與細(xì)胞壁的五個(gè)甘氨酸交聯(lián)橋的氨基形成酰胺鍵，從而使表面蛋白被錨定到細(xì)胞壁的肽聚糖上。

在金黃色葡萄球菌中，SrtA 將金黃色葡萄球菌的表面蛋白錨定到細(xì)胞壁上，進(jìn)而促進(jìn)金黃色葡萄球菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和定殖，促進(jìn)對(duì)宿主可溶性細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，產(chǎn)生致病作用和逃避宿主免疫防御的能力。如果能夠阻斷SrtA的錨定過程，致病菌就無法表現(xiàn)出強(qiáng)烈的致病性，且易被機(jī)體免疫系統(tǒng)所識(shí)別。一項(xiàng)對(duì)多種革蘭氏陽性菌進(jìn)行SrtA基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SrtA的缺乏會(huì)使病原菌無法正常將表面蛋白錨定到細(xì)胞壁上，從而很大程度降低了病原菌的致病性。因此，SrtA被視為抗金黃色葡萄球菌感染治療中極值得嘗試的抗毒力靶點(diǎn)。近年來，對(duì)于SrtA抑制劑的篩選也正成為抗菌藥物研發(fā)中的熱點(diǎn)。

2 材料和方法

2.1 Sortase A 活性測(cè)試

所有化合物的抑制活性通過使用Sensolyte?520 Sortase A試劑盒，測(cè)定5-FAM/QXL?FRET底物熒光強(qiáng)度來確定。反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，每個(gè)孔包含10L試驗(yàn)化合物溶液、40L酶溶液和50L Sortase底物溶液。所有化合物溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，并用滅菌蒸餾水稀釋。DMSO的最終濃度為1%。每種化合物在緩沖液中稀釋至試驗(yàn)濃度，并檢查其固有熒光。我們使用不含試驗(yàn)化合物的酶作為對(duì)照，使用1%二甲基亞砜對(duì)照和底物對(duì)照。以試劑盒抑制劑4-羥基汞苯甲酸（hmb）為陽性對(duì)照。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1h，并在ex/em=490nm/520nm下進(jìn)行熒光分析（spectramax gemini xs，ca，usa）。報(bào)告數(shù)據(jù)為三次實(shí)驗(yàn)的均值。

2.2 酶的結(jié)構(gòu)的獲取

金黃色葡萄球菌Srt A的三維結(jié)構(gòu)文件是從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載的。水分子被去除，酸性電荷分配給蛋白。配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)從pubchem數(shù)據(jù)庫中檢索得到。使用MarvinSketch 16.11.21（ChemAxon Ltd.，Budapest，Hungary）進(jìn)行優(yōu)化。選擇化合物：白楊素，大黃素，金雀異黃素，楊梅素，柚皮苷，槲皮素，奎尼酸，大黃酸，蘆丁。

2.3 蛋白質(zhì)-配體相互作用預(yù)測(cè)

分子對(duì)接是使用AutoDock Tools 1.5.6圖形用戶界面進(jìn)行的，該界面運(yùn)行AutoDock VINA 1.1.2軟件（Scripps Research Institute，San Diego，CA，USA）。AutoDock VINA是一個(gè)對(duì)接平臺(tái)，比以前的對(duì)接軟件AutoDock 4[14]更快、更精確。這個(gè)新的版本產(chǎn)生了蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物從最低結(jié)合自由能（DG）到最高結(jié)合自由能（DG）的九種構(gòu)象（poses）。

Discovery Studio?Visualizer 2016（Accelerys Software Inc.，San Diego，CA，USA）用于蛋白質(zhì)配體的三維可視化和二維圖的相互作用的可視化。

此外，還使用ligplot plus v.1.4（European Bioinformatics Institute，Cambridge，UK）程序預(yù)測(cè)了參與疏水相互作用的殘基數(shù)量。

2.4 抗菌活性測(cè)試

使用革蘭陽性金黃色葡萄球菌ATCC 6538、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、表皮葡萄球菌ATCC 12228，井?dāng)U散法和肉湯微量稀釋法（iso 20776-1）測(cè)定MIC。試驗(yàn)微生物在冷凍條件下保存，并通過營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)激活，37℃的肉湯培養(yǎng)24h。使用隔夜培養(yǎng)獲得接種物，將大量細(xì)胞從肉湯轉(zhuǎn)移到含有5ml脫鹽水的試管中，直到達(dá)到1～2 *108菌落形成單位（CFU）/ml的濁度，相當(dāng)于0.5 McFarland。在添加5%羊血的營(yíng)養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)接種物的稀釋液，以驗(yàn)證無污染和接種物的有效性。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用Graphpad Prism 5.01版軟件（Graphpad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA）對(duì)Srt A的抑制作用統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)（p＜0.05）對(duì)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

計(jì)算抑制率值，并根據(jù)濃度對(duì)數(shù)繪制曲線，使用最小二乘法計(jì)算相應(yīng)曲線。致死濃度（LC50）產(chǎn)生的L%值等于50，通過曲線插值確定。只要獲得的結(jié)果允許，計(jì)算95%置信區(qū)間的上下限和相關(guān)系數(shù)（r2）。

3 結(jié)果

3.1 Srt A活性測(cè)定

根據(jù)Srt A的分子多樣性和我們先前研究得出的規(guī)則，共選擇了9種天然化合物作為Srt A活性的初步篩選。候選分子是小分子，具有低折疊性和至少兩個(gè)氫鍵受體。在所檢測(cè)天然化合物中，有4種化合物對(duì)Srt A有明顯的抑制作用，其中2種化合物對(duì)Srt A有較好的抑制作用。

在初步篩選的基礎(chǔ)上，用不同濃度的化合物進(jìn)行抑菌活性評(píng)價(jià)。抑制活性定義為與陰性對(duì)照組相比，引起Srt A活性（IC50）降低50%的化合物濃度。結(jié)果見表1（NC：結(jié)果無法計(jì)算 NT：低濃度無法檢測(cè)）。

表1 對(duì)Srt A的抑制作用

從結(jié)果中可以得出楊梅素對(duì)SrtA的作用最強(qiáng)，其IC50比七葉亭低8倍。槲皮素和大黃酸在10μM時(shí)有很好的抑制效果，但它們?cè)谒械娜芙舛容^低，故無法測(cè)得高濃度時(shí)的抑制率。

3.2 蛋白配體相互作用

楊梅素具有較高的對(duì)SrtA的抑制活性和結(jié)合親和力，這很可能是由于它能與兩個(gè)極性殘基GLU105，ARG197形成氫鍵。此外，楊梅素還能與GLY167結(jié)合。據(jù)報(bào)道，槲皮素主要通過GLY167殘基的親和產(chǎn)生抑制SrtA活性。楊梅素還與殘基SER116、THR180通過范德華力相互作用。蛋白質(zhì)-楊梅素復(fù)合物產(chǎn)生8個(gè)疏水殘基相互作用和四種π鍵相互作用。此外，楊梅素的構(gòu)象還能阻礙酶與其他底物之間的相互作用，從而產(chǎn)生抑制SrtA的活性。與其他化合物相比，楊梅素含有的兩個(gè)酚羥基使其在SrtA結(jié)合位點(diǎn)上以更有效的方式定向。

表2 擴(kuò)散法測(cè)定的化合物的抑菌圈直徑（mm）

圖1 楊梅素作用SrtA 30分鐘后的濃度抑制曲線

圖2

圖2 （A）楊梅素SrtA復(fù)合物的對(duì)接構(gòu)象和相互作用；（B）二維結(jié)構(gòu)圖預(yù)測(cè)的相互作用（灰色：蛋白質(zhì)骨架 綠色：β螺旋紅色：α螺旋；相互作用：綠色氫鍵，紫色π-σ相互作用，淺紫色π-烷基相互作用）

3.3 抗菌活性

化合物的抗菌活性首先通過擴(kuò)散試驗(yàn)篩選，然后采用肉湯微量稀釋法檢測(cè)。表2顯示了大黃素和大黃酸的抑制圈直徑。從中可以看出大黃素和大黃酸對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌ATCC25923，表皮葡萄球菌ATCC12228具有較強(qiáng)的抑制作用。沒有一種化合物對(duì)革蘭氏陰性菌具有抗菌活性。

根據(jù)初步分析，只有大黃素和大黃酸產(chǎn)生了顯著的抑菌活性。我們測(cè)定了大黃素和大黃酸對(duì)所選菌株的MIC值。結(jié)果顯示大黃素比大黃酸具有對(duì)所有菌的抑制作用。由此推測(cè)可進(jìn)一步開發(fā)含1.8-二羥基蒽醌的衍生物。

表3 化合物的MIC值（μg/mL）

4 討論

經(jīng)過初期的篩選，楊梅素和七葉亭因其較好的IC50值，被初步判定為SrtA抑制劑。將這些值與各種已知的SrtA抑制劑進(jìn)行比較，楊梅素的抑制活性也是相對(duì)可以的。楊梅素和槲皮素，蘆丁一樣，屬于黃酮醇，它們都有3-羥基黃酮主鏈結(jié)構(gòu)。通過體外研究和計(jì)算機(jī)模擬發(fā)現(xiàn)黃酮醇骨架上的羥基的數(shù)目和位置對(duì)產(chǎn)生SrtA抑制活性是必要的。由于槲皮素在水中的低溶解度，IC50值檢測(cè)有限。但分子對(duì)接分析表明，高濃度的黃酮苷元對(duì)SrtA的作用比相應(yīng)的糖苷強(qiáng)。這個(gè)觀察與之前關(guān)于SrtA抑制劑結(jié)構(gòu)特征中可旋轉(zhuǎn)的數(shù)量小于或等于4一致。

七葉亭是咖啡酸分子內(nèi)環(huán)化形成的內(nèi)酯型肉桂酸的衍生物。它表現(xiàn)出良好的SrtA抑制作用。而咖啡酸及其甲氧基衍生物，反式阿魏酸，沒有表現(xiàn)出較好的SrtA抑制活性。產(chǎn)生這種結(jié)果差異的原因可能在于化合物的順反構(gòu)象，羰基和與ARG197之間氫鍵作用。七葉苷是七葉亭的6-O-葡萄糖苷，也產(chǎn)生低SrtA抑制作用，因?yàn)樗鄙僖粋€(gè)重要的氫鍵供體，即6-羥基。