黃酮抗金黃色葡萄球菌感染靶點SrtA的活性研究

林 銳

（江蘇醫藥職業學院，江蘇鹽城 224000）

1 前言

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），也稱“金葡菌”，是常見的革蘭氏陽性菌，具有較強的致病力，可引起多種嚴重感染。最常見的金黃色葡萄球菌引發的感染是局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心臟內膜炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。流行病學資料顯示，革蘭氏陽性菌感染中金黃色葡萄球菌發病率位居首位，是燒傷創面感染、急性肝功能衰竭等疾病的重要病原菌。

感染金黃色葡萄球菌，通常可選用紅霉素、新型青霉素、慶大霉素、萬古霉素或先鋒霉素Ⅵ治療，但由于抗生素的濫用，出現多種耐受抗生素的新菌株。1961年臨床上首次分離出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（mythically-resistant staphylococcus aureus，MRSA），該菌對所有內酰胺類抗生素耐藥，并對大環內酯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等抗菌藥物多數耐藥，可以抵抗強力的抗生素和藥物，并能夠引起各種感染，因此也被稱為“超級細菌”（Superbug）。細菌的耐藥問題使得可用的藥物也越來越少，對于高耐藥和多藥耐藥的MRSA，萬古霉素、替考拉寧或利奈唑胺成為最后的救命藥物。但其他國家已報道有耐萬古霉素金黃色葡萄球菌（vancomycin-resistant staphylococcus aureus，VRSA） 檢出，利奈唑胺耐藥的菌株亦有報道。

面對嚴峻的抗菌藥物用藥形勢，如何減少耐藥菌株的生成和研制新的抗菌藥物已是醫藥領域的熱點議題。在尋找新型結構的藥物替代現有抗生素的過程中，研究者會考慮幾方面的問題。一方面，隨著傳統的微生物來源的抗生素或其衍生物逐漸失效，植物來源以及天然產物來源的抗生素不失為更好的選擇。另一方面，病原菌對抗生素產生耐藥機制促使我們需要發掘抗生素殺滅或抑制病原菌的新靶標，去避免新的藥物在短時間臨床使用中也造成耐藥性的情況。

革蘭氏陽性菌的表面蛋白與其致病性密切相關，其表面蛋白是在細胞質中合成，通過Sortase的轉肽作用進而錨定到菌體細胞壁肽聚糖上[6]。Comfort，Dramsi等對892種表面蛋白的分選信號進行了分析，根據Sortase所識別的分選信號的不同，將Sortase分為A、B、C、D共4類，分別以SrtA，SrtB，SrtC，SrtD加以表示。SrtA識別LPXTG 基序，主要介導與黏附相關的表面蛋白的錨定，是最典型的家族蛋白。

SrtA是一種膜結合巰基轉肽酶，由206個氨基酸組成，它的N端部份是一個跨膜區，C端部份則是一個催化區域。SrtA能識別表面蛋白C端所含的保守氨基酸序LPXTG（X指任意的氨基酸），并裂解蘇氨酸（T）和甘氨酸（G）間的肽鍵，產生一個蘇氨酸的羰基末端，與細胞壁的五個甘氨酸交聯橋的氨基形成酰胺鍵，從而使表面蛋白被錨定到細胞壁的肽聚糖上。

在金黃色葡萄球菌中，SrtA 將金黃色葡萄球菌的表面蛋白錨定到細胞壁上，進而促進金黃色葡萄球菌對宿主細胞的黏附和定殖，促進對宿主可溶性細胞外基質的黏附，產生致病作用和逃避宿主免疫防御的能力。如果能夠阻斷SrtA的錨定過程，致病菌就無法表現出強烈的致病性，且易被機體免疫系統所識別。一項對多種革蘭氏陽性菌進行SrtA基因敲除實驗發現，SrtA的缺乏會使病原菌無法正常將表面蛋白錨定到細胞壁上，從而很大程度降低了病原菌的致病性。因此，SrtA被視為抗金黃色葡萄球菌感染治療中極值得嘗試的抗毒力靶點。近年來，對于SrtA抑制劑的篩選也正成為抗菌藥物研發中的熱點。

2 材料和方法

2.1 Sortase A 活性測試

所有化合物的抑制活性通過使用Sensolyte?520 Sortase A試劑盒，測定5-FAM/QXL?FRET底物熒光強度來確定。反應在96孔板中進行，每個孔包含10L試驗化合物溶液、40L酶溶液和50L Sortase底物溶液。所有化合物溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，并用滅菌蒸餾水稀釋。DMSO的最終濃度為1%。每種化合物在緩沖液中稀釋至試驗濃度，并檢查其固有熒光。我們使用不含試驗化合物的酶作為對照，使用1%二甲基亞砜對照和底物對照。以試劑盒抑制劑4-羥基汞苯甲酸（hmb）為陽性對照。反應在室溫下進行1h，并在ex/em=490nm/520nm下進行熒光分析（spectramax gemini xs，ca，usa）。報告數據為三次實驗的均值。

2.2 酶的結構的獲取

金黃色葡萄球菌Srt A的三維結構文件是從RCSB PDB數據庫下載的。水分子被去除，酸性電荷分配給蛋白。配體的化學結構從pubchem數據庫中檢索得到。使用MarvinSketch 16.11.21（ChemAxon Ltd.，Budapest，Hungary）進行優化。選擇化合物：白楊素，大黃素，金雀異黃素，楊梅素，柚皮苷，槲皮素，奎尼酸，大黃酸，蘆丁。

2.3 蛋白質-配體相互作用預測

分子對接是使用AutoDock Tools 1.5.6圖形用戶界面進行的，該界面運行AutoDock VINA 1.1.2軟件（Scripps Research Institute，San Diego，CA，USA）。AutoDock VINA是一個對接平臺，比以前的對接軟件AutoDock 4[14]更快、更精確。這個新的版本產生了蛋白質-配體復合物從最低結合自由能（DG）到最高結合自由能（DG）的九種構象（poses）。

Discovery Studio?Visualizer 2016（Accelerys Software Inc.，San Diego，CA，USA）用于蛋白質配體的三維可視化和二維圖的相互作用的可視化。

此外，還使用ligplot plus v.1.4（European Bioinformatics Institute，Cambridge，UK）程序預測了參與疏水相互作用的殘基數量。

2.4 抗菌活性測試

使用革蘭陽性金黃色葡萄球菌ATCC 6538、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、表皮葡萄球菌ATCC 12228，井擴散法和肉湯微量稀釋法（iso 20776-1）測定MIC。試驗微生物在冷凍條件下保存，并通過營養培養激活，37℃的肉湯培養24h。使用隔夜培養獲得接種物，將大量細胞從肉湯轉移到含有5ml脫鹽水的試管中，直到達到1～2 *108菌落形成單位（CFU）/ml的濁度，相當于0.5 McFarland。在添加5%羊血的營養瓊脂上培養接種物的稀釋液，以驗證無污染和接種物的有效性。

2.5 統計分析

使用Graphpad Prism 5.01版軟件（Graphpad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA）對Srt A的抑制作用統計分析。采用t檢驗（p＜0.05）對重復試驗結果進行分析。

計算抑制率值，并根據濃度對數繪制曲線，使用最小二乘法計算相應曲線。致死濃度（LC50）產生的L%值等于50，通過曲線插值確定。只要獲得的結果允許，計算95%置信區間的上下限和相關系數（r2）。

3 結果

3.1 Srt A活性測定

根據Srt A的分子多樣性和我們先前研究得出的規則，共選擇了9種天然化合物作為Srt A活性的初步篩選。候選分子是小分子，具有低折疊性和至少兩個氫鍵受體。在所檢測天然化合物中，有4種化合物對Srt A有明顯的抑制作用，其中2種化合物對Srt A有較好的抑制作用。

在初步篩選的基礎上，用不同濃度的化合物進行抑菌活性評價。抑制活性定義為與陰性對照組相比，引起Srt A活性（IC50）降低50%的化合物濃度。結果見表1（NC：結果無法計算 NT：低濃度無法檢測）。

表1 對Srt A的抑制作用

從結果中可以得出楊梅素對SrtA的作用最強，其IC50比七葉亭低8倍。槲皮素和大黃酸在10μM時有很好的抑制效果，但它們在水中的溶解度較低，故無法測得高濃度時的抑制率。

3.2 蛋白配體相互作用

楊梅素具有較高的對SrtA的抑制活性和結合親和力，這很可能是由于它能與兩個極性殘基GLU105，ARG197形成氫鍵。此外，楊梅素還能與GLY167結合。據報道，槲皮素主要通過GLY167殘基的親和產生抑制SrtA活性。楊梅素還與殘基SER116、THR180通過范德華力相互作用。蛋白質-楊梅素復合物產生8個疏水殘基相互作用和四種π鍵相互作用。此外，楊梅素的構象還能阻礙酶與其他底物之間的相互作用，從而產生抑制SrtA的活性。與其他化合物相比，楊梅素含有的兩個酚羥基使其在SrtA結合位點上以更有效的方式定向。

表2 擴散法測定的化合物的抑菌圈直徑（mm）

圖1 楊梅素作用SrtA 30分鐘后的濃度抑制曲線

圖2

圖2 （A）楊梅素SrtA復合物的對接構象和相互作用；（B）二維結構圖預測的相互作用（灰色：蛋白質骨架 綠色：β螺旋紅色：α螺旋；相互作用：綠色氫鍵，紫色π-σ相互作用，淺紫色π-烷基相互作用）

3.3 抗菌活性

化合物的抗菌活性首先通過擴散試驗篩選，然后采用肉湯微量稀釋法檢測。表2顯示了大黃素和大黃酸的抑制圈直徑。從中可以看出大黃素和大黃酸對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌ATCC25923，表皮葡萄球菌ATCC12228具有較強的抑制作用。沒有一種化合物對革蘭氏陰性菌具有抗菌活性。

根據初步分析，只有大黃素和大黃酸產生了顯著的抑菌活性。我們測定了大黃素和大黃酸對所選菌株的MIC值。結果顯示大黃素比大黃酸具有對所有菌的抑制作用。由此推測可進一步開發含1.8-二羥基蒽醌的衍生物。

表3 化合物的MIC值（μg/mL）

4 討論

經過初期的篩選，楊梅素和七葉亭因其較好的IC50值，被初步判定為SrtA抑制劑。將這些值與各種已知的SrtA抑制劑進行比較，楊梅素的抑制活性也是相對可以的。楊梅素和槲皮素，蘆丁一樣，屬于黃酮醇，它們都有3-羥基黃酮主鏈結構。通過體外研究和計算機模擬發現黃酮醇骨架上的羥基的數目和位置對產生SrtA抑制活性是必要的。由于槲皮素在水中的低溶解度，IC50值檢測有限。但分子對接分析表明，高濃度的黃酮苷元對SrtA的作用比相應的糖苷強。這個觀察與之前關于SrtA抑制劑結構特征中可旋轉的數量小于或等于4一致。

七葉亭是咖啡酸分子內環化形成的內酯型肉桂酸的衍生物。它表現出良好的SrtA抑制作用。而咖啡酸及其甲氧基衍生物，反式阿魏酸，沒有表現出較好的SrtA抑制活性。產生這種結果差異的原因可能在于化合物的順反構象，羰基和與ARG197之間氫鍵作用。七葉苷是七葉亭的6-O-葡萄糖苷，也產生低SrtA抑制作用，因為它缺少一個重要的氫鍵供體，即6-羥基。