種豬精液檢測中移液器的應用

朱 丹 張鳳鳴 陳 東 潘紅梅*

（1.重慶市畜牧科學院/農業部養豬科學重點實驗室/重慶市養豬工程中心，重慶 402460；2.四川省蒼溪胰河鄉畜牧獸醫站，四川蒼溪 628427）

隨著豬人工授精技術的普及，種豬常溫精液產品已被廣大養豬人接受。大部分小型豬場和散養戶已不再飼養種公豬，而是直接購買制作好的種豬常溫精液用于配種。種豬常溫精液在生產前、生產后及使用前，都必須要經過嚴格的質量檢查和評價，質量合格的精液方能用于發情母豬輸配。其中，種豬精液稀釋前檢查原精的活力和原精的密度尤其重要。根據國家標準《種豬常溫精液》（GB-23238-2009）的要求，原精稀釋后的種豬常溫精液產品精液劑量為80～100ml，精子活力≥60%，每劑量精液中直線前進運動精子數≥25億。其中每劑量中精子數以血球計數板計數精子，獲得原精的密度值。檢測計算公式為：每劑量中精子數=5個中方格中的數子數×5（即25個中方格的總精子數）×10（1mm3內的精子數）×1000（每毫升精液的精子數）×20（精液稀釋倍數）/50（根據原精密度大小調整）×劑量值。此計算公式可簡化為：每劑量中精子數=5個中方格中的數子數×100萬/250萬×劑量值。由此計算公式可知，準確取樣進行檢測是確保獲得準確的原精密度值，準確確定精液稀釋倍數，保證種豬常溫精液產品質量的基本前提。在取樣過程中，即使是很小的取樣誤差都會對檢測結果產生顯著影響。

傳統的玻璃取樣吸管或刻度管因其粗糙的制作、精度差和操作麻煩等原因已被精密度高，操作方便的微量移液器取代，目前，手動微量移液器已被廣泛應用于種豬精液抽樣和精液質量檢測中。與所有的精密儀器一樣，若采用正確的操作技術使用移液器，并在使用過程中注意所有的操作細節，其結果有很強的可重復性。不幸的是，種豬常溫精液生產單位和質量檢測單位的技術人員很少或根本沒有接受過規范的移液器操作和養護培訓，在檢測過程中正確的移液器操作技術和必須注意的細節常被忽視，且移液儀器的定期校準和適度保養基本被忽略。筆者長期從事種豬精液質量的檢測和抽檢工作，深感正確使用移液器的重要性和目前技術推廣中問題的嚴重性，故總結此文，以供同行參考。

1 移液器的分類

自1956年德國科學家Heinrich·Schnitger發明可調式移液器至今，移液器已發展出繁多的種類，其分類方法也各不相同。

根據移液器的物理學原理可分為空氣置換式移液器（或氣體活塞式，Air displacement）和正向置換式移液器（或外置活塞式，Positive Displacement）兩種。空氣置換式移液器適用于標準溶液移液，例如水、緩沖液、稀釋的鹽溶液和酸堿溶液。其活塞位于移液器的內部，通過活塞的伸縮改變空氣體積，同時產生壓力從而提供液體移動原動力即液體的吸取或排放，活塞與液體不接觸。正向置換移液器主要應用于黏稠度較大的液體如糖漿、甘油等，易揮發溶液，易產生氣泡的液體的移液。需要配合專用的吸頭使用，其活塞位于移液器外，置于吸頭/毛細管內部，通過活塞的伸縮引起液體的移動。活塞與液體直接接觸，兩者之間沒有空氣段，可以更好地保護液體樣本，最大限度地避免交叉污染，能提高粘滯液體吸入或排出量的準確性和精密度。

根據移液器所用動力分，可分為手動移液器和電動移液器。根據移液器所帶吸頭的數量分，可分為單通道移液器和多通道移液器。

種豬精液檢測實驗室常用的移液器為手動單道移液器。這是一種量出式量器，其移液量是由一個配合良好的活塞在活塞套內移動的距離來確定。主要由顯示窗、容量調節部件、活塞、O-形環、吸引管和吸頭（也稱槍頭）等部分組成。

2 手動單道移液器常用的移液技術

移液器的正確操作技術是完成合格檢測的第一步，錯誤的操作容易產生移液偏差，導致實驗結果不準確。在精液檢測中因為原精稀釋倍數大，取樣量小，檢測人員必須掌握正確的移液技術，減少檢測結果的誤差。

2.1 正向移液技術

空氣置換式移液器的操作按鈕有兩個位置：第一停點和第二停點。如圖1所示，當使用正向移液技術吸液時，先用大拇指將操作按鈕按下到第一停點（1.準備），再將移液吸頭浸入到樣品中，然后緩慢釋放操作按鈕回原點，吸入所需要的樣品量（2.吸液）。吸出樣品后，需要用吸水紙吸干吸頭外多余的樣品，以確保移出的樣品量為實驗所需要的設定量。排液時，先將吸頭緊貼容器壁，按下操作按鈕到第一停點，排出吸頭內的樣品（3.排放一）。為了讓吸頭內的樣品全部排完，操作按鈕的第一停點稍加停頓后，還需繼續將操作按鈕按壓至第二停點（4.排放二），排盡吸頭內所有樣品后再緩釋放操作按鈕回彈至原位，最后松開按鈕（5.復原）。

正向置換式移液器只能采用正向移液技術進行操作。

圖1 正向移液技術操作示意圖

2.2 反向移液技術

反向移液技術一般用于轉移高粘液體、生物活性液體、易起泡液體或極微量的液體。

如圖2所示，當使用反向移液技術吸液時，直接將操作按鈕壓至第二停靠點（1.準備），再將吸頭浸入樣品液面，同時控制操作按鈕緩慢回彈至原位，再松開操作按鈕，吸入所需要的樣品量（2.吸液）。排液時，先將吸頭緊貼容器壁，把操作按鈕按至第一停點，排出吸頭內的樣品（3.排放），隨后將吸頭頂部剩余的樣品廢棄或還原至容器，釋放操作按鈕至原點（4.復原）。

圖2 反向移液技術操作示意圖

3 精液檢測中適用的移液器和移液技術

精液稀釋劑一般是普通的鹽溶液，可以用空氣置換式移液器和正向移液技術進行操作。不推薦用反向移液技術移取水性溶液，因為這個技術在吸取水性溶液時，吸取的樣品量往往會超過儀器校準時確定的量。

無論是原精還是稀釋精液都屬于黏性液體，在取樣移液時應對其進行特殊考慮。使用空氣置換式移液器和正向移液技術對精液樣品進行取樣時可能會產生不準確的結果，因為吸液時，精液會在吸頭的內壁形成一層薄膜，導致排液時樣品不能完全從吸頭內排盡。因此，在移取精液樣品時推薦使用正向置換式移液器或空氣置換式移液器的反向移液技術。

移取精液樣品時，先將液體吸入，再打出，重復2～3次進行吸頭浸潤，致吸頭內壁吸附一層液體，使吸頭內表面達到飽和，最后將吸取的精液樣品移至目的容器，這樣操作吸取的樣品體積會更準確，特別注意在排液前要仔細擦干凈吸頭外壁的液體。

4 精液檢測中的移液器使用技巧

4.1 量程的選擇和調節方法

首先要根據取樣量選擇合適量程的移液器。雖然移液器的可用量程范圍是移液器最大量程的10～100%，但移液體積越接近所選移液器的最大量程，移液的準確性越好。如需要取樣70μl，最好選擇最大量程為100μl的移液器，而不用最大量程為200μl的移液器。

調節量程的正確方法應為：當移液器的量程需要從大體積調為小體積，按照正常的調節方法，即逆時針旋轉旋鈕至目標量程即可；當移液器的量程需要從小體積調為大體積時，則可先順時針旋轉刻度旋鈕至超過目標量程的刻度，再回調至目標量程，這樣可以保證量取的最高精確度。這樣的操作可以排除移液器內部機械間隙造成的影響，使移液更加準確，而且整個調節過程要注意動作輕緩。

特別注意，千萬不能將調節旋鈕旋出量程，否則會卡住內部機械裝置而損壞移液器。

4.2 吸頭填充方法

在精液檢測實驗中，檢測人員常習慣將移液器下端垂直插入吸頭，并上下強力敲打吸頭，以期使吸頭緊密地填充上緊。但這種填充吸頭的方法會影響移液器的氣密性導致吸液不準，長期如此操作還會造成移液器內部零件因經常性的撞擊而松散，甚至會導致調節刻度的旋鈕卡住，影響移液器的使用。

填充吸頭的正確方法為將移液器下端垂直插入吸頭，左右小幅度旋轉上緊即可。

4.3 浸潤吸頭有利于提高精液取樣準確性

移取精液樣品時，由于精液有一定的黏稠度，會在吸頭上形成掛壁現象，因此移液時最好先潤洗吸頭。具體方法是吸液時先將液體吸入，再打出，重復2～3次進行吸頭浸潤，這樣吸頭壁會吸附一層液體，使吸頭內表面達到飽和，再吸液后排出的體積會更準確。浸潤過程還可以幫助檢查是否有氣密性不好導致的漏液現象。

吸液后，保持吸頭在液面下停留幾秒，使移液器的彈簧充分回彈至設定位置再把移液器拿出，可以提高吸液量的準確性，避免因彈簧回彈不充分，吸頭下方進入部分空氣和氣泡影響吸液的準確性。

4.4 吸頭取樣角度和浸入深度

移液吸頭浸入液面的角度不同對移液效果也會有影響，劉麗[1]通過實驗證明垂直加樣是準確度最好的吸液角度。同樣移液吸頭浸入液體的深度對移液量也會有一定的影響。浸入過淺，可能會吸入空氣，導致移液量不準；浸入過深，可能會因為額外增大的壓力致移液量偏高。劉麗的實驗結果顯示吸頭浸入深度在4～10mm時比較，吸取血清、水、異戊醇和無水乙醇的變異系數分別為0.12、0.09、0.39和0.24，遠小于浸入深度＜4mm和＞lOmm的結果。說明移液時吸頭浸入液面達到4～10mm時吸液準確性明顯提高。

4.5 吸頭吸液的速度

移液器取樣時吸液的速度也很關鍵，如果吸液過快會產生反沖和氣泡影響移液的準確性，有的還會將液體吸入活塞，造成再次使用時交叉污染，嚴重時還會造成移液器漏液，活塞和密封圈損壞。所以正確的操作應該是緩慢吸液，這不僅可以使實驗準確還可以延長移液器的使用壽命。

4.6 移液器的放置

移液器使用完畢，應將量程調至最大刻度，再豎直掛在移液器架上。

當移液器槍頭里有液體時，切勿將移液器水平放置或倒置，以免液體倒流腐蝕活塞彈簧。

5 精液檢測實驗室移液器的維護與常見故障處理

在精液檢測實驗中使用移液器需要適當保養，且遇到常見故障要學會處理。

（1）氣密性檢測 將吸取液體后的移液器垂直靜置15s，觀察是否有液滴緩慢的流出。若有流出，說明有漏氣現象。

（2）移液器漏氣的處理 如果有漏液則更換吸頭后再試，如果繼續漏液須更換移液器再操作。漏液的移液器需送到專業部門進行檢修。

（3）準確性檢測

量程小于1μl：建議使用分光光度法檢測。

量程大于1μl：用稱重法檢測。通過對水的稱重，轉換成體積來鑒別移液器的準確性。

送至有資質的計量監測機構作專業校準。