豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法建立應(yīng)用

徐國(guó)翔

（深圳市坪山區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東深圳 518118）

豬瘟是一種烈性傳染病，具有高致死性，豬瘟病毒（CSFV）是其主要引發(fā)因素，病豬通常會(huì)有出血或母豬流產(chǎn)等特征出現(xiàn)。該病傳播速度較快，致死率偏高，在傳播過(guò)程中通常借助呼吸道、消化道，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織在必須報(bào)告的傳染病中對(duì)豬瘟進(jìn)行了明確規(guī)定。因該病對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)所造成的危害十分嚴(yán)重，故而農(nóng)業(yè)部也在動(dòng)物疫病中納入了該病。

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR是上世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種能夠準(zhǔn)確定量核酸分子的新技術(shù)，其主要優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)DNA以及機(jī)體mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，因此很快應(yīng)用于病毒學(xué)研究[1]，為對(duì)豬瘟病毒進(jìn)行檢測(cè)，本文通過(guò)反復(fù)檢測(cè)試驗(yàn)，成功建立了特異性豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和樣品

豬瘟病毒（CSFV）、豬O型口蹄疫病毒（O-FMDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）的滅活疫苗，購(gòu)自中牧實(shí)業(yè)公司，通過(guò)多次凍融后用于RNA/DNA提取。

1.1.2 儀器設(shè)備與主要試劑

磁珠法全自動(dòng)核酸提取試劑盒；MagMAXTMExpress核酸提取儀；世紀(jì)元亨豬瘟通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒；ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 模板制備

借助MagMAXTMExpress核酸提取儀，以磁珠法全自動(dòng)核酸提取試劑盒說(shuō)明書為根據(jù)分別對(duì)PPV、PRV、PCV2的DNA和O-FMDV、PRRSV、CSFV的RNA進(jìn)行提取。將提取的DNA/RNA用于PCR擴(kuò)增或儲(chǔ)存于-20℃處，備用。

1.2.2 精密度試驗(yàn)

將同一瓶CSFV疫苗分成6份進(jìn)行RNA提取，并以此作模板進(jìn)行試驗(yàn)。X軸為CT值，Y軸選用Rn，進(jìn)行CSFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法精密性驗(yàn)證。

1.2.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

設(shè)計(jì)一組樣品，這一組樣品中含有豬瘟病毒的樣品和不含有豬瘟病毒的樣品都需包括，并送到具備豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RTPCR檢測(cè)能力的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。

1.2.4 特異性試驗(yàn)

以選中的反應(yīng)體系、條件為參考，擴(kuò)增制備于1.2.1中的PPV、PRV、PCV2的DNA和O-FMDV、PRRSV、CSFV的RNA，并設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗(yàn)

精密度檢測(cè)結(jié)果（見圖1）：6次檢測(cè)CT值分別為23.2、23.4、23.3、23.7、23.6、22.9，變異系數(shù)為1.10%。

圖1

2.2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

對(duì)設(shè)計(jì)的一組樣品進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果一致，因此該方法檢測(cè)CSFV具有良好的準(zhǔn)確度。

2.3 特異性試驗(yàn)

借助本文所制定的方法擴(kuò)增含的CSFV的疫苗，會(huì)有陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)出現(xiàn)，而PPV、PRV、PCV2、O-FMDV、PRRSV的核酸模板并未有陽(yáng)性擴(kuò)增出現(xiàn)（見圖2），說(shuō)明本方法具有良好的特異性。

圖2

3 討論

對(duì)于中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)而言，CSFV所造成的危害十分嚴(yán)重。當(dāng)前，我國(guó)擁有眾多豬瘟疫苗生產(chǎn)企業(yè)，但是所生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量之間差異十分明顯，時(shí)常出現(xiàn)失敗的免疫，再加上CSFV臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜，缺乏典型性病例，僅靠臨床癥狀幾乎無(wú)法確診。快速、特異、敏感的分子生物學(xué)診斷方法的研發(fā)有利于CSFV的快速檢測(cè)[2]、CSFV病原陽(yáng)性豬的淘汰及凈化豬群豬瘟。

該方法采用提取樣品中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可檢測(cè)多種樣品陽(yáng)性豬瘟病毒，而特異性擴(kuò)增并未在其它不含CSFV的樣品中出現(xiàn)，準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果也成立，這表明了該方法具有較為良好的特異性、精密度和準(zhǔn)確度。

綜上所述，本文所提出的CSFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法具備快速、特異、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，故而在CSFV快速檢測(cè)中十分適用。