HPLC法測定心痛顆粒中阿魏酸含量

陳文明 廖建萍（通訊作者） 歐陽榮 范金茹 王芳 李珊 肖望重 黃莉

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院 湖南 長沙 410007）

心痛顆粒是根據湖南中醫藥大學第一附屬醫院范金茹教授多年臨床經驗總結而成的經驗方發展而來，原使用劑型為湯劑，由柴胡、川芎、郁金、桃仁、蒲黃、瓜蔞皮、甘草等10味藥組成，具有活血化瘀，行氣止痛的功效。主要用于不穩定型心絞痛屬氣郁痰瘀互結證的治療。前期研究結果表明該方在改善冠心病合并頸動脈斑塊證屬痰瘀互結氣郁患者中醫證候方面明顯優于西藥[1]；與常規治療不穩定性心絞痛的西藥合用在改善中醫證候、緩解心絞痛、停減硝酸甘油使用及降低血清MMP-2濃度等方面均明顯優于單用西藥[2]。本研究擬建立心痛顆粒中阿魏酸的含量測定方法，用于制劑的質量控制，現將研究結果報道如下。

1.儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀；島津AUX220型電子分析天平；SK5200H型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；DHG101型電熱恒溫鼓風干燥箱（北京中興偉業儀器有限公司）。

1.2 試藥

阿魏酸對照品（批號：181218），購自中國食品藥品檢定研究院；心痛顆粒由湖南中醫藥大學第一附屬醫院生產（批號：20181109、20181227、20190110）；甲醇為色譜醇，水為純化水，其余均為分析純。

2.方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XD3-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-1%醋酸溶液（30:70）；流速1ml/min；檢測波長321nm；柱溫25℃；進樣量10μl。理論板數按阿魏酸峰計算應不低于4000。

2.2 實驗溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取心痛顆粒約2.0g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.2 陰性對照品溶液的制備 取除川芎外的心痛顆粒其余處方量藥材，按心痛顆粒制備工藝制備缺川芎藥材的陰性對照樣品，照“2.2.1”項下方法制備缺川芎藥材的陰性對照品溶液。

2.2.3 對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加70%甲醇制成每1ml約含20μg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 干擾實驗 按“2.1”項色譜條件，取“2.2”項下3種溶液各20μl，依次進樣檢測。結果顯示，供試品溶液中其他成分未干擾測定。高效液相色譜圖見圖1～圖3。

圖1 阿魏酸對照品

圖2 心痛顆粒供試品

圖3：缺川芎藥材陰性對照品

2.3.2 線性范圍的考察 精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10μl，依次注入液相色譜儀，按“2.1”項色譜條件測定，以阿魏酸進樣量（μg）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程為：Y=14.277，X=6.2134，r=0.9999（n=5）。結果表明，阿魏酸進樣量在0.048～0.24μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度實驗 精密吸取對照品溶液5μl，重復進樣6次，測得阿魏酸峰面積值。結果峰面積的RSD為0.68%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性實驗 取心痛顆粒樣品6份，按“2.2.1”項方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別測定阿魏酸的峰面積。結果峰面積的RSD為1.16%（n=6），表面該實驗方法重復性良好。

2.3.5 穩定性實驗 精密吸取同一供試品溶液，分別在0，4，8，12，16，24h時進樣測定阿魏酸的峰面積。結果峰面積的RSD為0.93%（n=6），表明心痛顆粒供試品溶液在24h內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收實驗 取已知含量的同一批號心痛顆粒樣品9份，平均分為3組，分別按樣品中阿魏酸量的80%、100%、120%加入阿魏酸對照品溶液，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，并計算加樣回收率，見表1。

表1 樣品中阿魏酸加樣回收率測定結果（n=9）

2.3.7 樣品測定 取3個批次的心痛顆粒樣品，按“2.2.1”項方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定各批次心痛顆粒中阿魏酸含量，見表2。

表2 心痛顆粒中阿魏酸含量測定結果

考慮到心痛顆粒處方藥材不同產地、不同批次間阿魏酸含量的差異，結合實驗研究過程中測量誤差，參照文獻報道[11-12]中有關阿魏酸含量的限度要求，擬確定心痛顆粒中阿魏酸的含量限度設定為不少于0.18mg·g-1。

3.討論

3.1 檢測波長的選擇

采用紫外分光光度法，將阿魏酸在200～400nm波長范圍內進行掃描，結果在321nm波長處有最大吸收，與《中國藥典》2015版一部“川芎”項下的檢測波長一致，同時供試品測定時在該波長處無干擾。因此，檢測時選擇321nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

根據藥典及文獻資料報道[3-9]，阿魏酸用HPLC法測定含量，選用的流動相有乙腈-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-1%醋酸等，前期實驗中，對以上流動相均進行了考察比較，結果采用甲醇-1%醋酸（30:70）為流動相，色譜峰基線平穩，分離度良好，理論板數符合要求。

3.3 含量測定指標的選定

一般來說，制劑的質量控制主要是對主藥有效成分的含量進行測定。根據心痛顆粒的組方原則，以疏肝豁痰化瘀法立方，方中柴胡疏肝解郁，瓜蔞清熱化痰、寬胸散結，川芎活血祛瘀、行氣止痛，又善能調肝，同為君藥。川芎中主含苯肽類、酚酸、生物堿等多種成分，其中酚酸類成分阿魏酸具有改善血液流動性、抑制血小板聚集、預防血栓形成等藥理作用[10]，其與心痛方主治病證氣郁痰瘀互結型不穩定型心絞痛相吻合。因此選用阿魏酸含量作為該制劑質量控制的主要測定指標。

3.4 樣品溶液的提取

供試品溶液制備時比較了加熱回流提取和超聲提取，結果兩種方法均能將阿魏酸基本提取完全，為簡化操作步驟，減少能耗，本實驗采用超聲提取30min提取心痛顆粒樣品。