人間充質干細胞外泌體研究進展

繆著，盧福瓊，馬波，劉馨

人間充質干細胞外泌體研究進展

繆著，盧福瓊，馬波，劉馨

650500，昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室（繆著、盧福瓊、馬波、劉馨）；653100 玉溪，云南時光肌生物技術有限公司（馬波、劉馨）

外泌體是一種能被大多數細胞分泌的微小膜泡，具有脂質雙層膜結構，直徑為 40 ~ 100 nm，密度為 1.13 ~1.18 g/ml。隨著以干細胞技術為核心的再生醫學的發展，間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）被廣泛應用于多種疾病的治療，研究表明，MSC 來源的外泌體通過核內體途徑產生，能夠起到與干細胞相似的生理作用，能夠保護腎臟損傷、減少心肌缺血和再灌注損傷、保護內毒素誘導的肺損傷、調節免疫系統功能等[1]。在早期的研究中，人們將 MSC 的治療效果歸因于局部移植和分化為各種類型細胞的能力，但隨著研究的進一步深入，人們發現 MSC 移植入體內后，不能長期存活，大部分細胞在血管中死亡。所以，推測產生的治療作用可能是依賴于旁分泌機制產生的大量生物活性因子。大多數健康或疾病環境的細胞能夠持續釋放細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）進入周圍環境，其中外泌體作為細胞間進行信息交流的重要工具有望替代干細胞移植。MSC 來源的外泌體已進入臨床試驗階段，主要針對急性缺血性腦中風、難治性黃斑孔裂、1 型糖尿病和阿爾茨海默癥。因此，對外泌體的培養方法和相關參數、分離方法進行改進和優化，對其蛋白質和核酸進行嚴格分析均是其應用于臨床的基礎。本文對人 MSC 外泌體的產生機制、內容物、獲取方法進行了綜述。

1 MSC 外泌體的生成機制

MSC 來源的外泌體通過核內體途徑產生，不同細胞來源外泌體有相似的合成路徑[2]。該過程始于細胞膜表面的內吞作用形成的早期內吞體，早期內吞體再成熟為晚期內吞體，晚期內吞體膜通過內向出芽作用，包裹特異分選的蛋白、核酸等物質形成多個管腔囊泡（ILVs），這種管腔囊泡即為外泌體的前體。晚期內吞體內包含多個 ILVs 后，即成為多泡體（MVB）。隨后，大多數 MVB 與溶酶體融合，導致 MVB 的內含物降解，而少數 MVB 的膜表面有 CD63、溶酶體跨膜蛋白（lysosomal membrane protein，LAMP）1、LAMP2 等，可介導其與細胞質膜融合，并向胞外釋放外泌體[3-4]。

1.1 依賴內吞體分選復合物機制

ILVs 與 MVB 的生成需要內吞體分選復合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）的輔助。ESCRT 是一種蛋白復合物，定位于內吞體胞質側，其主要作用為分選特異的組分進入ILVs，進而構成外泌體的前體。ESCRT 包含了四種復合體（ESCRT-0、I、II、III）及輔助蛋白（VPS4、VTA1、ALIX 等），各自發揮著不同的作用。四種復合體在生成 ILVs 和 MVB 的過程中發揮的作用各不相同，ESCRT-0 識別和分隔泛素化標記的內吞體膜跨膜蛋白，含有肝細胞生長因子調控的酪氨酸激酶，后者可以識別泛素化的蛋白；HRS 可以募集 ESCRT-I 中的 TSG-101，而后 ESCRT-I 通過 ESCRT-II 或 ALIX 蛋白的作用募集 ESCRT-III 發揮作用，使內吞體膜通過內向生芽作用包裹特異的內容物；ESCRT-III 將形成的囊泡剪開。此外，ESCRT 的解離和再循環需要 ATP 酶 VPS4 的輔助作用，ESCRT-0、ESCRT-I 和 VPS4 在外泌體的生成中具有重要作用，且不同細胞的外泌體生成存在異質性[5-6]。

1.2 非依賴內吞體分選復合物機制

細胞不依賴 ESCRT 也可生成 ILVs 及 MVB。通過脂質、神經酰胺、四跨膜蛋白家族 tetraspanins 或熱休克蛋白等的作用輔助生成 ILVs 及 MVB。Tan 等[7]利用鞘磷脂酶抑制劑處理 MSC，證明外泌體的產生依賴于鞘磷脂酶，這與 MVB 內泌體出芽需要神經酰胺的假設是一致的。中性鞘磷脂酶可以水解鞘磷脂生成神經酰胺，而抑制該酶的作用可減少神經酰胺的生成，進而降低 MVB 膜的內向生芽作用，減少外泌體的生成。磷脂酶 D2 可將卵磷脂水解生成磷脂酸，磷脂酸可以像神經酰胺一樣促進 MVB 膜的內向生芽作用，并包裹特異的蛋白生成 ILVs，促進外泌體的生成[8]。上述表明，磷脂酸和神經酰胺可以不依賴 ESCRT 的作用而生成外泌體。ADP 核糖基化因子 6 是質膜及內吞體膜上的一種小 G 蛋白，可激活磷脂酶 D2，使卵磷脂水解生成磷脂酸。目前，tetraspanin 蛋白超家族分選外泌體內含物的作用也已被闡明。此外，有研究發現 CD81 也可分選一系列配體等進入外泌體[5]。

2 MSC 外泌體的組分及生物學功能

細胞外囊泡（EV）是細胞主動釋放的納米級膜泡，可以根據其來源、大小與生物學特性分為三類：外泌體、微囊和凋亡小體[9]，如表 1 所示。

1983 年，Johnstone 等首次在綿羊網織紅細胞中發現外泌體，但一直被認為是一種細胞廢棄物。2010 年 MSC 來源外泌體首次在心肌缺血/再灌注損傷模型中被研究。研究表明，骨髓 MSC 比成肌細胞、人急性單細胞白血病細胞系（THP-1）、人胚胎腎細胞系（HEK）等能產生更多的外泌體。MSC 來源的微囊對部分組織器官也有再生功能，包括腎臟、神經組織、肝臟和肺[10]。外泌體外層結構為磷脂雙分子層，表面攜帶有來源細胞特定的膜結構物質，內容物豐富，例如蛋白質、脂質和核酸，通過靶細胞內化、受體-配體相互作用或脂膜融合進行傳遞[11-12]。根據外泌體最新數據庫（http://www.exocarta.org/），已確定其中存在有 9769 種蛋白質、3408 種 mRNA 和 2838 種 miRNA。

表 1 細胞外囊泡的主要類型

2.1 蛋白質

外泌體中的蛋白來源于母細胞、內吞途徑和細胞質，與細胞內吞網絡相關，通常不包含內質網、線粒體或細胞核蛋白質。MSC 外泌體除表達所有外泌體共同表達的標志物之外，還表達 MSC 細胞膜上的一些黏附分子，如 CD29、CD44、CD73、CD90、CD105[13-14]。另外還存在一些其他種類的蛋白，例如：可作為標記并用于外泌體鑒定的多泡體源蛋白（例如 Alix 和 TSG101）；與維持細胞結構相關的細胞骨架蛋白（例如肌動蛋白和微管蛋白）；可以調節膜骨架的動態性以及膜融合的膜聯蛋白（I、II、V 和 VI）；與信號轉導相關的轉導蛋白、與細胞代謝相關的載體蛋白和一些組織相容性抗原也廣泛存在于外泌體中[15]。據 ExoCarta 介紹，已經從 MSC 來源外泌體中收集了 900 多種蛋白質。與其他細胞來源外泌體相似，MSC 外泌體的蛋白組成可以反映宿主細胞的生理和病理狀態，也可以隨應激和微環境的變化而變化，從不同批次 MSC 條件培養基獲得的外泌體的蛋白成分存在差異。

2.2 脂質

MSC 外泌體具有脂筏結構的特征，是一個在質膜中具有內吞活性的微結構域。脂筏富含膽固醇和飽和磷脂，如鞘磷脂等[7]。鞘脂神經酰胺已被證明與外泌體產生有關。從 MSC 外泌體中分離得到的脂肪酸包括白三烯、花生四烯酸（AA）、磷脂酸、前列腺素溶血磷脂酰膽堿（LPC）和二十二碳六烯酸（DHA）[16]。外泌體中所含有的脂質成分與其來源細胞的種類有很大關系，也存在一定的差異。這些脂類分子不僅參與了維持外泌體的形態，還可以作為信號分子參與許多生物學過程。如：對 Notch 等腫瘤生存信號通路的抑制，引起細胞凋亡，以及對前列腺素、磷酸激酶 A2、磷酸激酶 C 和磷酸激酶 D 等中間信號分子的傳遞，參與細胞間通訊[17]。雖然脂質在囊泡穩定性中起著重要作用，但MSC 外泌體脂質的生物學和藥理作用仍有待進一步闡明[16]。

2.3 核苷酸

外泌體含有大量具有生物活性的遺傳學物質，這是把外泌體與囊泡區分開來的最重要特征。MSC 外泌體內的核酸主要有 miRNA 和 mRNA。許多 miRNA 已經被發現在 MSC 來源外泌體中參與生理和病理過程，如機體發育、表觀遺傳調控、免疫調節、腫瘤發生和進展[18]。mRNA 可以參與細胞周期、血管生成及組蛋白修飾等進程[19]。miR-16 是一種在 MSC 來源外泌體中富集的 miRNA，靶向體內和體外腫瘤中血管內皮生長因子（VEGF），下調其表達來抑制血管生成和腫瘤進展[20]。從臍帶 MSC 衍生的外泌體中釋放的 let-7f、miR-145、miR-199a 和 miR-221 在很大程度上有助于抑制丙型肝炎病毒[21]。miR-21 是一種抗凋亡 miRNA，在 MSC 外泌體中濃度最高。MSC 外泌體通過促進肌生成和血管生成促進肌肉再生，是由 miR-494 等 miRNA 介導的[10]。脂肪 MSC 外泌體中最豐富的 5 種 miRNA 是 miR-486-5p、miR-10a-5p、miR-10b-5p、miR-191-5p 和 miR-222-3p；而骨髓 MSC 外泌體中 miR-143-3p、miR-10b-5p、miR-486-5p、miR-22-3p、miR-21-5p 占 miRNA 總量的 43% ~ 59%[22]。另外，外泌體也含有少量線粒體 DNA（mtDNA）、piRNA、長鏈非編碼 RNA（lncRNA）、核糖體 RNA（rRNA）、snRNA、snoRNA 和 tRNA[4]。

3 MSC 外泌體的獲取

3.1 離心法

為了開發外泌體在診斷和治療中的應用，建立一個有效的方式來分離外泌體，且最小限度地改變它們的結構和含量是十分必要的。目前公認的黃金標準是差速超速離心。差速超速離心法利用不同蛋白質分子及囊泡、細胞及細胞碎片等在均勻懸浮液中的沉降速度存在差異，通過逐漸增強離心力和離心時間來分離細胞、碎片和細胞器等，從而得到外泌體[23]。一般采用 300 ×離心 10 min，2000 ×離心10 min去除死亡細胞，10 000 ×離心 20 min 去除細胞碎片和大分子蛋白質，100 000 ×離心 2 h 得到目的微球，然后用 0.22 μm 濾膜過濾除去凋亡小體和微囊。楊向榮等[24]將生長良好的 P3至 P5臍帶 MSC 在 37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中使用無血清培養 48 h，收集上清液，4 ℃保存放置過夜，采用上述方法分離外泌體，在–80 ℃凍存。

高速離心法往往不能區分外泌體、小的囊泡以及部分蛋白質，通常配合蔗糖密度梯度法提高外泌體純度。外泌體和其他所有脂質囊泡一樣漂浮在蔗糖梯度中，其密度范圍從 1.13 g/ml（B 細胞來源外泌體）~ 1.19 g/ml（腸道細胞來源外泌體），凋亡細胞釋放的蛋白質和核酸碎片等雜質漂浮在蔗糖密度梯度中，經高速離心分離達到純化的目的[23]。

目前，離心法提取外泌體還有待進一步確立標準，不同的轉速、離心力、離心時間和樣本性質均可能導致結果不同。

3.2 沉淀法

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）具有極強的親水性，可與疏水性的脂質雙分子層結合，改變外泌體的溶解度或分散性使其沉淀?？梢杂糜谘?、血漿、腹水、尿液外泌體的分離，一般配合離心法和 0.22 μm 濾膜來提高外泌體的純度。梁亞會等[25]建立了一種利用 PEG 6000 溶液低速離心從骨髓 MSC 培養上清中分離外泌體的方法。將細胞培養上清于常溫 3000 ×離心 20 min，去除細胞及細胞碎片，收集上清 0.22 μm 濾膜過濾除去大的顆粒及囊泡，加入 8% 5 × PEG 6000 試劑，4 ℃靜置過夜后，3000 ×離心 30 min，棄上清，離心管倒扣于吸水紙上風干 5 ~ 10 min，根據沉淀的量加入適量的 PBS 重懸，再次 5000 ×離心 20 min，棄上清，根據獲得外泌體的量加入適量 PBS 重懸，即獲得骨髓 MSC 外泌體。

基于沉淀原理的試劑盒均加入了 PEG，先低速離心去除細胞碎片和蛋白質顆粒，再加入試劑混合均勻，靜置一段時間后離心得到外泌體。郭瑩等[26]對差速離心法、Exo Quick 試劑盒法、Total Exosome Isolation 試劑盒法提取人臍帶 MSC 外泌體進行比較，差速超速離心法提取的外泌體中的蛋白濃度和純度最高，Exo Quick 試劑盒法其次，Total Exosome Isolation 試劑盒法得到的蛋白濃度最低；但差速離心法和 Total Exosome Isolation 試劑盒法耗時長。不同品牌的外泌體提取試劑盒的用法和用量都會存在差異，具體提取方法應根據說明書進行操作。

3.3 超濾法

超濾法是根據外泌體的大小使用相應截流分子量的超濾膜，配合離心或加壓來分離外泌體。該法通過離心和壓力收集到的外泌體差異較大。近來，Lobb 等[27]指出，50 ~ 200 ml樣本更適合采用離心法，當樣本量達到 400 ml 以上時更適合采用壓力法。胡國文等[28]采用旋轉超濾技術從骨髓 MSC 培養上清中分離外泌體。按離心法除去細胞碎片，以及 0.22 μm濾膜過濾后，將上清液加入裝有 100000NW-CO 超濾膜的 Model 8050 旋轉超濾儀中，接通氮氣，并將最大通氣壓力控制在 517.125 kPa 以下，打開磁力攪拌器，使漩渦高度為液體高度的 1/3，待上清液超濾完畢后，加入 50 ml PBS 再次超濾，重復 3 次。超濾完畢后，用 0.5 ml PBS 懸浮超濾膜上的外泌體，轉移至 EP 管中，放–80 ℃凍存。基于外泌體的粒徑、蛋白質和脂質與物料間的相互作用力，采用凝膠滲透色譜柱能實現外泌體與雜質的高效分離，但色譜柱不能反復多次使用，限制了該方法的發展[29]。

3.4 抗體親和捕獲法

用磁性粉末包被的單克隆抗體微顆粒，能與外泌體膜表面蛋白特異性結合。王靜等[30]用免疫磁珠法分選脂肪間充質干細胞外泌體，使用 CD81 標記的磁性微珠，與 PBS 和外泌體按一定比例混合，在 2 ~ 8 ℃條件下孵育過夜，第2 天離心收集管底沉淀，得到免疫磁珠-外泌體復合物，PBS 洗滌后可用于流式細胞檢測。

3.5 微流控技術分離法

微流控技術是 2012 年以后發展起來的外泌體分離新技術，可分為免疫親和、篩分、多孔結構捕獲三類[31]。因其對小體積樣本的處理能力以及對生物顆粒的分離能力而引起廣泛關注，在生物醫學研究、分析化學、分子化學等領域得到廣泛應用[32]。免疫分離是通過表面帶有人字形凹槽的固定裝置，依賴于外泌體表面的受體，使其與裝置表面特異性抗體結合，再用適當的洗脫液洗脫，使其與其他脫落膜顆粒和脂質結構分離。依據 MSC 外泌體的表面標記，可選擇相應抗體進行特異性收集。上述幾種分離外泌體方法的優缺點比較詳見表 2。

4 體外培養人 MSC 外泌體的臨床應用研究

MSC 來源于發育早期的中胚層和外胚層，屬于多功能干細胞，其具有多向分化潛能、造血支持、免疫調控和自我復制等特點，是干細胞家族的重要成員，存在于骨髓、肝臟、脾臟、成人的骨骼肌、外周血、脂肪、韌帶、胎盤、臍帶、臍血、皮膚等組織中。2006 年國際間充質及組織干細胞委員會對人來源 MSC 實驗研究提出 3 條最低鑒定標準：①在標準培養條件下，MSC 必須具備對塑料底物的貼附特性；②通過流式細胞儀檢測，MSC 群體表達 CD105、CD73 及CD90 陽性率≥ 95%，且 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a 或 CD19、HLA-DR 的陰性表達率≥ 98%；③在體外，通過標準方法誘導，MSC 必須能向成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞分化。

表 2 外泌體的分離方法比較

MSC 經過體外培養后，細胞體積增大、歸巢能力降低以及移植入體內的生存能力較差。使用外泌體進行無細胞治療比基于干細胞的應用提供了以下優勢：①解決了可能與活細胞和增殖細胞群移植相關的若干安全隱患，包括免疫相容性、致瘤性、栓塞和感染傳播；②可以在不使用潛在毒性的冷凍保護劑的情況下長期保存而不會喪失產品效力，即在儲存、處理和產品保質期方面有更大的優勢；③在受控的實驗室條件下通過特定的細胞系可以大規模生產，且來自“好細胞”的外泌體攜帶許多 MSC 的再生蛋白；④外泌體符合納米顆粒的定義，體積相對較小，因此更容易穿過血腦屏障到達大腦的缺血區域或疾病位點；⑤外泌體中的內容物可以通過不同的培養條件來控制，在未來的研究中，可以通過對培養條件進行實施和修訂，以擴增具有定制治療特性的 MSC 來源外泌體的產品[33]。

在北美臨床試驗注冊中心（http://clinicaltrials.gov）上可以檢索到與 MSC 來源外泌體相關的臨床試驗有4 項，分別為評估其通過富集 miR-124 對急性缺血性腦卒中的治療作用、通過 miRNA-136,494,495 在外泌體內的表達來提早預測子癇前期、比較 MSCs 及其來源外泌體對難治性黃斑裂孔的促愈合作用以及評估微泡和外泌體在治療 1 型糖尿病和 β-細胞缺失中的效果。除此之外，MSC 來源外泌體也運用于靶向治療、載藥、組織修復、神經疾病治療、免疫調節、腫瘤抑制等方面[34]。研究表明，MSC 外泌體含有細胞因子和細胞因子生長因子，如 TGFβ1、白細胞介素-6（IL-6）、IL-10 和肝細胞生長因子（HGF），有助于免疫調節[11]。MSC 外泌體中還包括 VEGF、細胞外基質金屬蛋白酶誘導物（EMMPRIN）、MMP-9 這三種蛋白質，對促血管生成起重要作用，也是組織修復的基礎。MSC 來源外泌體也是合適的遞藥系統，是天然的納米顆粒，且具有修飾的可塑性，人們還嘗試通過基因轉染技術進行外泌體表面修飾，提高組織靶向性和治療效果[35]。所以，外泌體的治療作用要廣泛的運用于臨床，仍需要臨床試驗的進一步驗證和支持。

5 體外培養條件對人 MSC 外泌體的影響

臨床試驗中可能需要數百微克至毫克的外泌體來治療患者，原代 MSC 數量很少，可以通過體外擴增培養，控制培養微環境來增加外泌體的產量和誘導有效成分的高表達。目前常用的培養細胞產生 EVs 體系有 2D 培養體系、3D 培養體系（包括支架和無支架）和生物反應器[36]。3D 培養體系可以彌補傳統 2D 培養體系在生理模式方面的缺失，但 3D 培養體系其支架組成會影響 EVs 的數量和質量，且更難去評估，再現性和可伸縮性也應該被考慮，EVs 的分離需要用酶進行消化，會影響 EV 的完整性和生物活性。生物反應器的優點在于 EV 的產量大，且在動態條件下培養，可以增強生物反應系統內的營養交換，但也必然會給 EV 的功能和特性帶來影響，例如，細胞接種的密度、老化程度、增殖代數、分化的不同時期、培養基基質的形貌、剛性、流體剪切應力以及周期性拉伸等細胞培養微環境下的因素均會對 EV 產生影響。細胞接種密度過大，會產生接觸抑制。長期的體外培養會加速 MSC 的老化，從而影響其可塑性和遺傳穩定性，并反映在 EV 的內容物上。細胞分化的不同階段分離出來的 EV 的 miRNA 的表達水平也不同。培養基質的溝槽和脊線會影響 MSC 的擴散和定向，使其朝向特定的譜系分化。培養基質的剛性也會影響細胞的表型。除此之外，在缺氧條件下培養細胞，會增加生長因子和抗炎分子的產生[37]。Moon 等[38]通過腦缺血組織提取物（IBE）處理刺激 MSCs 釋放 EV，以模擬腦缺血生物化學微環境，可以成功獲得大量具有多種神經源性和血管生成因子的 MSC 來源 EV，用于治療卒中。

6 問題與展望

人 MSC 外泌體可以用作無細胞成分的再生性藥物，主要是基于其質量、復制性以及它們的制備過程，在同種方式下，這些參數也反映了基于人 MSC 治療的效果。因此，MSC 外泌體應用于臨床仍存在以下問題：①外泌體成分并不是靜態的，是 MSC 活動及其細胞間通訊所產生的，可被靶細胞內化后，改變其生物學性能。在人 MSC 與腫瘤細胞共培養或者處于體內腫瘤微環境下，外泌體的成分也會發生改變。所以，在 MSC 外泌體的制備過程中，培養環境及參數決定了外泌體的生物學作用；②外泌體內容物豐富，但具體的有效成分及作用機制仍待進一步開發研究；③外泌體獲取方法差異性較大，需要進一步優化提高其產量和純度?？偠灾?，涉及MSC 來源外泌體質量控制的標準化協議應該被構思并有效應用于臨床，包括：①體外培養 MSC 產生外泌體的定向培養方法及相關參數；②外泌體理想的純化獲取方法；③外泌體的物理特性和標準化表征；④外泌體中脂質、蛋白質和 miRNA 的分析標準。

綜上所述，MSC 外泌體克服了細胞移植存在的問題，來源更廣，保存、運輸更方便，能夠起到與干細胞相似的作用，且有望通過明確有效成分后，在培養過程中誘導其特異性高表達，開發針對特定疾病的外泌體產品，使“無細胞”治療有望替代干細胞治療，成為干細胞與再生醫學領域的重要研究方向之一。

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劉馨，Email：fluidstar@126.com

2019-05-22

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.013