芹菜素衍生物芫花素對非洲豬瘟病毒感染的抑制作用

張愛瓊 ，梁海英，曾智勇 （編譯）

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬一種雙鏈DNA病毒。常引起豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病，發病率高，病死率可高達100%。最近，非洲豬瘟病毒在歐盟國家和中國暴發流行，嚴重威脅著畜牧產業的健康發展，給養殖業帶來了巨大的經濟損失。由于目前沒有有效的疫苗和抗病毒藥物對其進行控制，使其進一步暴發蔓延成為可能。基于非洲豬瘟疫情的暴發與流行，Hakobyan A 等對抗ASFV 的有效抗病毒藥物進行了研究。

芹菜素是一種植物來源的黃酮類化合物，該化合物以其生物活性而聞名，包括對丙型肝炎病毒、腸道病毒-71 和口蹄疫病毒的抗病毒作用。然而，芹菜素在化學上是不穩定的并且幾乎不溶于高極性溶劑，例如水，在植物中它通常以衍生形式存在。Hakobyan A 等在研究中為評估商業上可獲得的芹菜素衍生物（葡糖基化或甲基化）對ASFV 的抗病毒活性，對金合歡素（Acacetin）、芹黃素葡糖苷（Apigetrin）、芫花素（Genkwanin）、野 漆 樹 甙（Rhoifolin）、 牡 荊 素(Vitexin)、牡荊素-2-O-鼠李糖苷（Vitexin-2-O-rhamnoside） 六 種 化合物（結構式見圖1A）進行了測試。其首先通過使用MTT[溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑]測定，在Vero 細胞（體外ASFV 感染的細胞）中篩選芹菜素衍生物的細胞毒性。結果顯示這6 種化合物可根據其細胞毒性特征分為兩組，野漆樹甙和芹黃素葡糖苷表現出很高的細胞毒性，表明C7 位的碳水化合物部分可能增加芹菜素衍生物的體外毒性。相比其余四種化合物，其中芫花素（595.1±45.5μM）和牡荊素-2-O-鼠李糖苷（409.1±50.2μM）顯示出比金合歡素（659.1±25.9μM）和牡荊素（783.5±64.5μM） 略 高 的 毒 性（圖1B）。同時在MEM 中制備的工作溶液中沒有觀察到DMSO 濃度（＜1%）的細胞毒性。

為了測試芹菜素衍生物是否具有抗ASFV 的抗病毒活性，其用ASFV/Ba71V 感染在96 孔培養板中生長的Vero 細胞，用芹菜素衍生物（每個化合物6 個孔）處理，金合歡素和牡荊素的濃度為20 μM，芫花素和牡荊素-2-O-鼠李糖苷的濃度為40 μM，感染進行了96 h，直到處理的細胞中發生總細胞病變效應（CPE）。收集上清液并通過基于CPE 的測定滴定，滴度通過Spearman-K?rber 終點法計算并表示為TCID50/ml。結果顯示，在所選擇的四種化合物中，只有芫花素顯著降低病毒滴度從6.5±0.1到4.75±0.25 log TCID/ml（圖1C）?；谀承S酮類化合物對DNA 和RNA 病毒具有直接地殺病毒活性，其首先進行了芫花素對細胞外ASFV 顆粒的影響研究，結果顯示處理和未處理的Vero 細胞之間病毒滴度的差異在統計學上是不顯著的，表明芫花素不能損害細胞外病毒顆粒。在細胞進入之前排除了芫花素的殺病毒活性。同時其對ASFV 病毒的附著和內化進行了測定，結果表明芫花素能夠干擾ASFV 感染的附著和內化階段，這與病毒進入宿主細胞密切相關并且是必需的，但確切機制還需進一步研究探索。由于ASFV向細胞表面的轉運依賴于微管，秋水仙堿和諾考達唑等微管蛋白聚合抑制劑能夠抑制細胞中ASFV 的釋放，通過研究后推測芫花素可能通過破壞沿著微管的病毒運動來抑制ASFV 從宿主細胞中的排出。

為了進一步證實其抗病毒效果，測定了用芫花素處理后ASFV細胞中病毒DNA 的數量。即將生長在蓋玻片上并用ASFV/Ba71V 菌株（2TCID50/細胞）感染的Vero 細胞暴露于濃度為10、20、40 μM 的芫花素中。在感染后16 h，將細胞在96%乙醇溶液中固定30 min，并通過Feulgen 的方法在新鮮的希夫氏試劑中染色。通過計算機配備的顯微鏡-細胞儀在575 nm 處測量病毒細胞的DNA 含量，并表示為集成光學密度（IOA）。結果顯示，在處理的Vero 細胞中，ASFV 含量顯著少于模擬處理細胞中的，表明40 μM 濃度的芫花素也可能阻礙病毒DNA 復制。當ASFV 感染的細胞暴露于芹菜素和染料木黃酮時獲得了類似的結果。

圖1 芹菜素衍生物的化學結構（A），細胞毒性（B）和抗ASFV 活性（C）

通過免疫印跡分析評估了在芫花素存在下早期（p32）和晚期（p72）病毒蛋白的表達，即在70 mm 培養皿中生長的Vero 細胞用ASFV/Ba71V 分離物感染，在吸附期后暴露于濃度為10、20、40 μM 的芫花素中。在蛋白質提取之前，將細胞在補充有蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物的冰冷改良RIPA緩沖液中裂解。使用聚丙烯酰胺分離凝膠對澄清的全細胞裂解物進行SDS-PAGE 凝膠電泳并通過電印跡轉移至0.2 μm 孔徑的硝酸纖維素膜上。用封閉液在室溫下封閉1 h 后，與特異性一抗孵育1 h，然后將膜與帶有HRP 的適當的二抗在室溫下孵育1 h，最后用PBST 洗滌3 次，并用化學發光檢測試劑盒檢測蛋白質。結果顯示，經40 μM 濃度的芫花素處理后，兩種蛋白質的合成均顯著降低，且較低濃度的芫花素的存在也對晚期但非早期蛋白質的合成有影響，表明該化合物可能主要通過未知機制干擾晚期ASFV 基因的表達。

在豬中，單核細胞和巨噬細胞是ASFV 感染的主要目標。因此，進行了實驗來確定芫花素對豬巨噬細胞中毒性ASFV 分離株（亞美尼亞/07）的影響。用與Vero 細胞實驗相同的芫花素濃度（40 μM）處理ASFV 感染的巨噬細胞，將巨噬細胞接種在96 孔板中，并通過血細胞吸附（HAD）測定進行滴定。測定顯示，在感染的早期或晚期加入芫花素后，ASFV 的產率顯著降低。兩個階段芫花素的影響表明，其可以阻止病毒進入和離開豬巨噬細胞。在病毒附著步驟中用芫花素處理豬巨噬細胞導致ASFV 產量從5.0±0.3 log HADU50/ml 降低至3.6±0.2 log HADU50/ml。當在ASFV感染的內化階段加入芫花素時，也觀察到顯著的抗病毒效果。病毒出口測定顯示，在豬巨噬細胞中第一輪ASFV 感染后釋放的病毒后代減少了1.2 log。這些結果表明，芫花素不僅能夠抑制ASFV Ba71V，還能夠抑制現在在歐洲和中國流行的高毒性ASFV 分離株。

總之，現已將芫花素鑒定為有效的抗ASFV 化合物，其靶向病毒進入和離開感染階段。芫花素可以抑制豬巨噬細胞中高毒性ASFV 分離株的復制，這強調了其作為抗病毒藥物開發候選物的價值。這是關于芫花素體外抗病毒活性的第一份報告，表明未來的研究可能擴大其作為抗病毒劑對抗其他病毒的應用范圍。