山東省豬瘟Erns 基因系統(tǒng)進化分析與表達模式的研究

蘭鄒然，張 月，楚遵鋒，徐淑華，田夫林，王金寶

(1.山東省動物疫病預防與控制中心,山東 濟南250022；2.山東省農(nóng)業(yè)廳,山東 濟南250002)

豬瘟(CSF)為黃病毒科瘟病毒屬成員,是嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一,傳染性很強,致死率較高,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將此病列為A 類傳染病之一[1]。世界上,包括亞洲、歐洲、中南美洲、部分非洲等許多國家采取了大規(guī)模的疫苗防控跟凈化措施,但是豬瘟仍然普遍存在[2]。20 世紀20 年代我國首次對該病進行了報道,此后的幾十年里,疫情接連不斷的發(fā)生。1954 年,Zhou 等[3]研發(fā)的豬瘟兔化弱毒疫苗雖然較好地控制了豬瘟在我國的廣泛流行,但20世紀70 年代末,我國包括山東省等多個省份仍就受到該病的危害。

豬瘟病毒為單股正鏈RNA 病毒,基因組大約12.5 kb,由一個大的ORF 編碼一個3 898 個氨基酸的多聚蛋白。該蛋白在細胞內(nèi)蛋白酶和病毒特異性的蛋白酶作用下裂解成各種成熟的結(jié)構(gòu)蛋白(S)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)。從N 端開始至C 端各蛋白質(zhì)分別是Npro、C、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B。其中,Erns和E2 是其主要的保護性抗原,且Erns具有RNase 酶活性,成為研究抗豬瘟病毒藥物重要的靶基因[4]。

全球豬瘟流行性病學調(diào)查對研究豬瘟病毒的起源與消滅起很大的作用。過去,多數(shù)研究是針對E2 基因。臺灣的豬瘟的流行性病學調(diào)查指明Erns和E2 具有相似的系統(tǒng)進化樹,且Erns比E2 在進化上更保守些[5]。本研究就是想通過對Erns的研究,進一步揭示山東省豬瘟病毒在中國以及全球豬瘟病毒系統(tǒng)進化中地位。

1 材料與方法

1.1 菌種及質(zhì)粒 E.coli Top10,購自生工生物工程(上海)股份有限公司；P.pastoris GS115 和P.pastoris 整合型分泌達質(zhì)粒pPIC9K 由山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所贈送。

1.2 試劑與工具酶 酵母完全培養(yǎng)基(YPD)、選擇培養(yǎng)基(MD)、甲醇選擇培養(yǎng)基(MM)、誘導培養(yǎng)基(BMGY)和甲醇誘導培養(yǎng)基(BMMY)按Invitrogen 公司說明書配制；Plasmid Miniprep kit 和Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 以及各種限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ和T4 DNA 連接酶Ex taq 酶,購自TaKaRa 公司；Tryptone Yeast 為OXOID 產(chǎn)品；YNB 為Solarbio 產(chǎn)品。

DL-2 000 DNA Marker、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker,購自 TaKaRa 公司；四甲基氨基甲烷(TEMED)D-山梨醇等,購自Promega 公司；過氧化物酶標記的二抗等為Sigma 公司產(chǎn)品；所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 病毒和細胞 采集山東省疑似豬瘟病料,包括淋巴結(jié)、腎臟、脾臟等,用GenBank 公布的引物[6]HCV-1:5′-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3′；HCV-2:5′-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3′開展RT-PCR檢測。將檢測為陽性的病料按照Liu,J.J 的方法[12]接種PK-15 細胞。

1.4 RT-PCR 和Erns基因的克隆 取帶毒細胞液200 μL,參照TRLZol Reagent 試劑說明書進行總RNA 的提取,空氣中自然干燥。用疫苗毒和滅菌水做陽性和陰性對照。

Erns基因的DNA 合成參照TIANGEN 的Quant One Step RT-PCR Kit 說明書進行。Erns基因的特異性引物為E0-1:(5′-GAAAATATAACTCAATGGAACCTG-3′)； E0-2: 5′-ACAGTAAGGCGATAGGGC-3′。PCR 反應體系為50 μL,反應條件為10×RT-PCR Buffer(5 μL),10 mmol/L dNTP Mixture each(2 μL),5×RT-PCR enhancer(10 μL),20 U RNasin,2.25 U Hotmaster Taq polymerase,Quant RTase for one step(0.5 μL),primer E0-1(10 μmol/L)(3 μL),primer E0-2(10 μmol/L)(3 μL),RNA(template)(1μg),ddH2O(23.5 μL)。一步法程序是:50 ℃(30 min),94 ℃(2 min),94 ℃(35 cycles 30 s),線性化53 ℃(30 s),延伸65 ℃(1 min),最終延伸65 ℃(10 min)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。

陽性PCR 產(chǎn)物用TIANGEN 公司的膠回收試劑盒回收并取4.0 μL 回收產(chǎn)物按TaKaRa 公司pMD18-T vector 說明書克隆入T 載體,經(jīng)初步鑒定后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 序列與系統(tǒng)進化分析 分析測序結(jié)果,獲得Erns基因的全長cDNA 序列,并對該序列進行生物信息學的分析,例如信號肽和糖基化位點預測。此外該序列經(jīng)NCBI BLAST 程序比對后,預測它的保守結(jié)構(gòu)域,并尋找同源基因的存在。用DNASTAR 軟件包中的MegAlign 程序分析36 株參考毒株的蛋白質(zhì)序列之間的相似性和趨異進化程度。序列比較的方法為CLUSTAL W 方法。采用Mega3.1 鄰接法(Neighbor-joining Method)構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹。利用TMHMM server v.2.0(Http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)軟件分析其是否含有跨膜區(qū)。

1.6 pPIC9K-Erns基因重組質(zhì)粒構(gòu)建 設(shè)計合成重組質(zhì)粒的特異性引物并擴增Erns基因,在5′端加EcoR Ⅰ位點,3′端加NotⅠ位點,引物序列如下:E0-3:5′-CGGAATTCGAAAATATAACTCAATGGAACCTG-3′和E0-4:5′-ATTTGCGGCCGCACAGTAAGGCGATAGGGC-3′。將Erns基因及pPIC9K 質(zhì)粒載體均用EcoRⅠ酶和NotⅠ酶雙切,瓊脂糖電泳,回收酶切片段；將雙酶切后的Erns基因片段及pPIC9K 片段用T4 DNA 連接酶進行連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)Top 10(AMP+),用含AMP+的LB 平板篩選陽性重組子,通過酶切PCR 和測序等方法鑒定陽性克隆。

1.7 目的蛋白的誘導表達 將重組表達質(zhì)粒pPIC9K-Erns和空質(zhì)粒pPIC9K 用SalⅠ酶切線性化,將其電轉(zhuǎn)化到Pichi apastoris GS115 酵母感受態(tài)中,取400 μL 鋪于YPD 平板上,28 培養(yǎng)3 d 挑選生長良好的單菌落接種于2 mL YPD 培養(yǎng)過夜后,取新鮮的菌液3 μL 進行PCR 鑒定,選特異性引物:AOX1:5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′；AOX2:5′-GCAA ATGGCATTCTGACATCC-3′,陽性菌落再利用G418 對Mut 型進行篩選。

選取PCR 鑒定且經(jīng)過篩選正確的重組菌接種至含10 mL YPD 培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)的試管中,30 ℃,200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜；次日以1%的比例(V∶V)接種至含100 mL BMGY 培養(yǎng)基(1.34%YNB、4×10-7生物素、10%甘油、1%酵母提取物、2%蛋白胨、5%甘油)的500 mL 三角瓶中,30 ℃,200 r/min 振蕩培養(yǎng)約24 h；離心并將菌體重懸于BMMY 培養(yǎng)基(1.34%YNB 4×10-7生物素、1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.5%甲醇)中,28 ℃,200 r/min 振蕩誘導表達4 d,每隔24 h 補加100%甲醇至終濃度為0.5%,按時間段取樣進行分析。

將工程酵母菌在BMMY 培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)一定時間后,離心分別收集沉淀和上清,并將培養(yǎng)上清用硫酸銨沉淀法初步純化,用2 倍上樣緩沖液與沉淀和純化的上清蛋白等量混合進行SDS-PAGE 試驗,以分析目的蛋白的表達。

1.8 蛋白印跡(Western-Blot)檢測 將SDS-PAGE的電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,用5%脫脂乳封閉。用CSFV 陽性豬血清進行Western-Blot 檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 Erns基因擴增產(chǎn)物的鑒定 我們從山東省豬瘟病毒株 SDCQ 中得到了 Erns基因(序列號:JQ911701),該cDNA 克隆全長為696 bp(圖1),編碼一個232 個氨基酸的蛋白質(zhì),其理論分子量為50 kDa。其蛋白質(zhì)具有RNA 酶的活性,包含一個RNase T2 結(jié)構(gòu)域。

圖1 Erns基因的片段擴增

2.2 序列與系統(tǒng)進化分析 經(jīng)NCBI 里的BLAST 和SMART program(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析發(fā)現(xiàn),該cDNA 編碼的蛋白質(zhì)比較保守,有RNase T2 保 守 結(jié) 構(gòu) 域。 TMHMM server v.2.0(Http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)軟件分析表明,Erns不具有跨膜區(qū)。對SDCQ 株Erns基因編碼的蛋白與其他36 株參考毒株的Erns基因編碼的蛋白進行系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn):這些毒株分為兩個基因群,4 個亞群(圖2),SDCQ 株屬于Subgroup 1.1a,此亞群是有德國株P(guān)aderborn、3 個臺灣毒株和7 個國內(nèi)株組成的,同源性在93%～99%之間,由此可以推測該亞群病毒擁有共同的祖先；與Subgroup 1.1b的同源性在91%～92%之間；而與Group2 中參考序列的同源性比較在84%～86%之間(見圖2)。五個疫苗株:LPC/AHRI(Taiwan),HCLV(China),Riems(Holland),Chinese C strain 和Chinese vaccine strain 聚集在一起,與Pan 等[5]之前研究得出的結(jié)論一致。值得注意的是,SDCQ 并沒有與國內(nèi)外經(jīng)典的具有代表意義的毒株聚集在一起,由此可知,山東省內(nèi)流行的CSFV 毒株與傳統(tǒng)強毒株和疫苗用毒株在主要抗原編碼基因上存在一定差異。

圖2 36 株CSFV Erns基因系統(tǒng)進化樹

分析SDCQ 和其他19 個參考毒株的氨基酸序列,Erns具有兩個保守區(qū)(CRs),分別位于aa 28 ～36和75 ～82 區(qū)域(圖3)。流行毒株與疫苗株在CR1 區(qū)域存在差異,位于36 位點的氨基酸E 被G 所取代。由此引出一個有趣的問題:此變化是否帶來毒力的變化?序列中位于30 位和79 位的H(組氨酸)為RNase 催化活性關(guān)鍵氨基酸殘基,此位點高度保守[6]。

2.3 pPIC9K/Erns重組質(zhì)粒與重組酵母菌的篩選

對重組質(zhì)粒進行PCR 和雙酶切鑒定。PCR 結(jié)果顯示,有與目的基因相符的696 bp 大小的條帶；然后雙酶切其質(zhì)粒,電泳結(jié)果顯示兩條帶,分別為9 kp 左右和696 bp(圖4A),陽性質(zhì)粒測序結(jié)果證明,Erns基因已正確插入pPIC9K 的多克隆位點上。

將電轉(zhuǎn)化后的菌落作為模板,AOX1 和AOX2為引物,進行PCR 檢測,電泳結(jié)果顯示1 173 bp 大小的條帶(圖4B),與目的產(chǎn)物大小相符,陽性重組菌測序結(jié)果證明,pPIC9K/Erns重組質(zhì)粒正確整合入酵母菌中。

圖3 20 株CSFV Erns氨基酸序列分析

圖4 重組質(zhì)粒與重組菌的鑒定

2.4 Erns基因表達產(chǎn)物的SDS-PAGE 和Western Blot 分析 將篩選的轉(zhuǎn)化子分別接種BMGY 和BMMY 培養(yǎng)基誘導表達后,將表達上清透析、濃縮后進行SDS-PA GE 結(jié)果顯示,GS115/ pPIC9K-Erns轉(zhuǎn)化子誘導產(chǎn)物在50 kD 處出現(xiàn)與預計的以同源二聚體形式存在的Erns大小相符的條帶(圖5A),與Western-Blot 結(jié)果顯示一致(圖5B),重組蛋白Erns可被CSFV 多抗血清識別,且顯示兩條雜交條帶。這一結(jié)果與van Gennip 等[7]研究結(jié)果相吻合。

圖5 表達產(chǎn)物SDS-PAGE 電泳及Western-Blot 分析

3 討論

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種急性接觸傳染性病毒病,對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重。豬瘟病毒是一種具有囊膜的單股正鏈RNA 病毒,屬于黃病毒科瘟病毒屬。 其基因組包含一個大的開放閱讀框(Open reading frame,ORF),編碼一種由約3 898 個氨基酸殘基組成的多聚體蛋白,該多聚體蛋白在病毒和細胞酶作用下加工成4 種結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns、E1、E2)和8 種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B)。

Erns是豬瘟病毒所有蛋白中比較特殊的一種囊膜糖蛋白,只存在于黃病毒科的瘟病毒屬,是一種高度糖基化的蛋白。糖蛋白分子量約占Erns總蛋白分子量的二分之一。在感染細胞中Erns在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積累,并可存在于病毒粒子表面或被分泌到胞外。所以,Erns蛋白很難在常用的細菌系統(tǒng)中獲得有活性的蛋白。畢赤酵母(Picha pastoris)是一種甲醇營養(yǎng)型酵母,能夠在以甲醇作為單一碳源的培養(yǎng)基上生長,既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作的特點,又具有真核生物的蛋白質(zhì)加工、折疊、翻譯后修飾的優(yōu)點,同時其遺傳比較穩(wěn)定,能夠密度發(fā)酵,蛋白的表達量高、且易于純化,因此,畢赤酵母現(xiàn)已成為現(xiàn)代分子生物學研究最重要的工具和模型,是表達外源基因比較理想的宿主。

本試驗從山東省豬瘟病毒株SDCQ 中擴增到了Erns基因全長696 bp,通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)SDCQ 并沒有與國內(nèi)外經(jīng)典的具有代表意義的毒株聚集在一起,由此可知,山東省內(nèi)流行的CSFV 毒株與傳統(tǒng)強毒株和疫苗用毒株在主要抗原編碼基因上存在較大差異。序列分析發(fā)現(xiàn),流行毒株與疫苗株在CR1 區(qū)域存在差異,位于36 位點的氨基酸E 被G 所取代,是否因此帶來毒力的變化,還需進一步證實。通過構(gòu)建pPIC9K-Erns重組質(zhì)粒,成功轉(zhuǎn)化和篩選到一株多拷貝的工程酵母菌,通過甲醇誘導培養(yǎng)分泌表達了一定量的Erns蛋白。Western-Blot 分析結(jié)果表明,表達的Erns蛋白能識別天然豬瘟多克隆抗體,具有生物學活性,同時證實Erns是以同源二聚體的形式存在。下一步試驗將大量誘導Erns蛋白,收集表達產(chǎn)物,經(jīng)過純化以期得到高產(chǎn)量蛋白,為基因工程疫苗和檢測試驗的研究奠定基礎(chǔ)。