人參水煎煮的科學性探索
——水煎煮引發人參皂苷化學結構的轉化△

楊秀偉，張雷

北京大學 藥學院 天然藥物學系/天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191

傳統中藥人參(Ginseng Radix et Rhizoma)系五加科多年生草本植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，馳名中外，獲譽“百草之王”。早在遠古皇帝時代，有關人參的神奇功效就已為人所知，人參已有4000多年的應用歷史；為了滿足需要，西晉末年，已經開始栽培人參，距今已有1600多年的歷史。有關人參的記載，見于春秋時期越國宰相范蠡著《范子計然》一書，書中有“人參出上黨，狀類人形者善”的描述。我國最早的藥學典籍《神農本草經》記載“人參味甘，主補五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目、開心、益智，久服輕身延年”。東漢時期名醫張仲景所著《傷寒論》一書中共有113個成方，其中含有人參的配方達21個，并論述人參具有“溫補、滋潤、強壯、強精、保溫、增強視力、安定精神”等作用。從古至今，人參或以“獨參湯”形式藥物應用，或以“配方”形式藥物應用，民間作為補品煲湯飲用。自1963年科學家從人參中分離鑒定出人參皂苷(ginsenoside，G)[1-2]以來，現代科學研究已充分證明，人參皂苷幾乎反映了人參的全部藥理學作用。由于人參為水煎劑形式用藥，本文探討人參水煎煮的科學性——水煎煮引發人參皂苷化學結構的轉化。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LCMS-8050超高效液相色譜-質譜聯用儀，包括Nexera X2 UFLC液相系統：LC-30AD二元泵、SIL-30AC自動進樣器、SPD-M30A檢測器、CTO-20AC柱溫箱；8050型三重四級桿定量質譜：配備ESI離子源和LabSolution工作站；Mettler XS105DU十萬分之一電子天平(METTLER TOLEDO，Zurich，Switzerland)；AR4120型萬分之一電子天平[奧豪斯國際貿易(上海)有限公司]；KQ5200超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，功率：200 W，頻率：40 kHz)。

1.2 材料

人參飲片(批號：PG-Y-201606)購自河北安國藥材市場，經本文作者之一楊秀偉教授鑒定為PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖。

對照品人參皂苷G-Re(1)、G-Rb1(2)、20(S)-G-Rh1(3)、20(S)-G-Rg2(4)、20(R)-G-Rg2(5)、G-Rc(6)、20(R)-G-Rh1(7)、G-Rb2(8)、G-Rb3(9)、G-Rd(10)、G-Rg6(11)、G-F4(12)、G-Rk3(13)、G-Rh4(14)、20(S)-G-Rg3(15)、20(R)-G-Rg3(16)、20(S)-PPT(17)、20(R)-PPT(18)、G-Rk1(19)、G-Rg5(20)、20(S)-G-Rh2(21)、20(R)-G-Rh2(22)、20(S)-PPD(23)、20(R)-PPD(24)，系本課題組從生曬參[3]、紅參[4]、人參莖葉[5]或人參莖葉總皂苷酸水解產物[6]中分離制備，純度經LC-MS驗證均大于98%。以上24個對照品的結構式見圖3～4。

LC-MS級別乙腈和甲醇購自Fisher Scientific Inc.(Pittsburgh，PA，USA)；色譜純級別乙腈、甲醇為天津西華特種試劑廠產品；超純水(18 MΩ·cm-1)為本實驗室用Milli-Q Advantage A10(Millipore，Billerica，USA)制水機自制；HPLC級別醋酸銨購自Sigma-Aldrich(Lot#BCBK6717V，Sigma-Aldrich，Co.，MO，USA)。

2 實驗條件和方法

2.1 實驗條件

液質分析C18色譜柱為Waters ACQUITY UPLC?BEH Shield RP18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Part#186002854，Ser# 01603514816023，Made in Ireland)；配有相同填料預柱Waters ACQUITY UPLC?BEH Shield RP18VanGuardTM Pre-Column(5 mm×2.1 mm，1.7 μm，Part#186003977，Lot#0158351601，Made in Ireland)。流動相為0.5 mmol·L-1醋酸銨水溶液(流動相A)和乙腈(流動相B)。采用梯度洗脫方式，梯度洗脫程序：0～3 min，20%～22%B；3～5 min，22%～30%B；5～9 min，30%～33%B；9～11 min，33%～35%B；11～13 min，35%～42%B；13～23 min，42%～47%B；23～24 min，47%～52%B；24～29 min，52%～55%B；29～29.1 min，55%～60%B；29.1～34 min，60%～65%B；34～36 min，65%～95%B。流速設為0.4 mL·min-1，柱溫控制在30 ℃，進樣體積為1 μL。

質譜參數優化結果如下：霧化氣流速：3 L·min-1；干燥氣流速：10 L·min-1；加熱氣流速：10 L·min-1；接口加熱器溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；接口電壓：-3.0 kV；檢測器電壓：1.80 kV。電離源為電噴霧離子源，掃描方式為多反應監測，掃描模式為負離子模式。

2.2 混合對照品溶液的配制

精密稱取各對照品適量，溶解于質譜級別甲醇中，制成質量濃度為1.0 mg·mL-1的對照品儲備液，分別移取適量儲備液混合并稀釋制成混合對照品母液。連續稀釋混合對照品母液得到一系列混合對照品線性工作液。

2.3 分析樣品的制備

2.3.1 水超聲提取 人參飲片粉碎過40目篩，準確稱取1 g加入40 mL水，常溫下超聲提取兩次，每次1 h，過濾，即得25 mg·mL-1(以生藥計)樣品溶液。再次用水稀釋至0.5 mg·mL-1(以生藥計)，平行制備兩份樣品。

2.3.2 水回流提取 稱取人參飲片5 g，加入275 mL蒸餾水，水回流提取2 h，過濾。濾渣再次加入275 mL蒸餾水回流2 h，過濾后合并兩次濾液，水浴蒸至約50 mL，加入100 mL乙醇使醇濃度約為65%，4 ℃靜置過夜，在3000 r·min-1離心10 min，收集上清。上清減壓濃縮除去乙醇后冷凍干燥，稱質量，密封保存。分析前分別稱取適量提取物溶解于甲醇制成25、0.5 mg·mL-1(以生藥計)的樣品溶液，平行制備兩份樣品。

3 結果與討論

在本課題組前期[7]對人參皂苷UFLC-MS/MS研究的基礎上，本研究發現，所有分析物均在負離子模式下有最大的響應。各分析物優化得到的保留時間、離子對信息、Q1能量、碰撞能量、Q3能量和滯留時間信息見表1。

表1 24個分析物保留時間及最優離子化參數

分別對分析方法的專屬性、系統適用性、線性、定量下限和檢測下限、重復性、提取回收率和穩定性進行了方法學考察，結果表明，該方法能夠用于上述24個分析物的含量測定[8]。(數據略)。

圖1為水超聲法提取人參飲片得到的MRM疊加圖，圖2為水回流提取人參飲片得到的MRM疊加圖，根據建立的UFLC-MS/MS對兩種提取物的定量分析結果總結見表2。

圖1 水超聲提取樣品中24個分析物的MRM疊加圖

圖2 水回流提取樣品中24個分析物的MRM疊加圖

常規上，如果將中藥粉末置于水中在常溫下提取，獲得的基本上是天然的原形化合物；而熱水回流提取可能得到人工產物。一般來說，人參中的原人參二醇型(protopanaxadiol，PPD)達瑪烷四環三萜在C-3或C-20結合糖鏈，天然者的手性C-20呈S型；原人參三醇型(protopanaxatriol，PPT)達瑪烷四環三萜在C-6或C-20結合糖鏈，天然者的手性C-20呈S型。表2定量分析結果表明，室溫下超聲提取，人參飲片中化合物3[20(S)-G-Rh1]、4[20(S)-G-Rg2]等收率較低，但熱回流的情況下其收率上揚。同時也可以觀察到，人參飲片中不含有它們的C-20差向異構體(epimer)，即化合物5[20(R)-G-Rg2]和7[20(R)-G-Rh1]，但在熱回流的情況下出現了化合物5和7，此已被許多研究所證實，即在人參加熱提取或煎煮處理中，天然的20(S)型PPD和/或PPT達瑪烷四環三萜易向20(R)型差向異構體轉化，這種轉化的結果不僅表現在它們溶解度上的改變，而且對其生物活性具有很大影響[2]，如表3所示的某些達瑪烷四環三萜對腫瘤細胞的細胞毒活性。

表2 不同提取方法人參提取物中人參皂苷的含量 mg·g-1

注：—表示未檢測到。

表3 某些達瑪烷四環三萜對腫瘤細胞的細胞毒活性 μmol·L-1

表2結果顯示，化合物5、7、11～24不存在于人參飲片中，但在熱回流處理人參飲片的情況下，這些化合物出現了。化合物1(G-Re)、2(G-Rb1)、6(G-Rc)、8(G-Rb2)、9(G-Rb3)和10(G-Rd)是生曬參中普通化合物[1，9-10]，除G-Rd外，它們應該是人參中的天然化合物，G-Rd很可能是天然人參皂苷生物合成的中間體或降解產物，有待研究證實。根據表2的檢測結果和化合物的化學結構特性，推測PPD型人參皂苷可能通過熱致活化水提供的能量促進糖苷鍵斷裂，發生非酶促反應，產生一系列降解產物，見圖3。G-Rb1、G-Rb2、G-Rb3、G-Rc等作為起始物逐級降解，產生結構多樣性的降解產物。

從表2結果也可看出，隨著煎煮，G-Rb1、G-Rb2、G-Rb3、G-Rc等的收量也在提高，可能來源于G-Ra1、G-Ra2、G-Ra3、G-Rs1、G-Rs2、G-Rs3[1]，丙二酰基人參皂苷(malonylginsenoside，MG)Rb1、Rb2、Rc等。作為PPT型人參皂苷可能通過熱致活化水提供的能量促進糖苷鍵斷裂，發生非酶促反應，產生一系列降解產物，見圖4。典型的降解反應，如從G-Re開始等，產生少糖基的稀有人參皂苷(rare ginsenoside)。

圖3 水煎煮所致PPD型人參皂苷的可能降解途徑

圖4 煎煮所致PPT型人參皂苷的可能降解途徑

4 討論

人參中的G-Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Re、Rg1等稱之為普通人參皂苷，存在于生曬參中。而目前將它們的降解、少糖基產物稱之為稀有人參皂苷，如G-Rg5、Rh1、Rh2、Rh3、Rh4、Rk1、Rk2、Rk3等。由于稀有人參皂苷較普通人參皂苷的糖基少，脂溶性相對增強，相對易于滲透組織器官或細胞，容易到達“靶點”發揮作用。在SIRT1(silent information regulator two homologue 1)模型研究中，以G-Rb1為例，在10、20 μmol·L-1對SIRT1活性無激活作用，而其降解產物稀有人參皂苷20(S)-G-Rg3、20(R)-G-Rg3、G-Rg5[11]以及20(S)-PPD和20(R)-PPD[12]具有較強的SIRT1激活作用；在PPT型皂苷中，以G-Re為例，在10、20 μmol·L-1對SIRT1活性無激活作用，而其降解產物稀有人參皂苷G-F4、G-Rh4[11]以及20(S)-PPT和20(R)-PPT[12]具有較強的SIRT1激活作用，且有不同的藥代動力學行為[13-15]，無論是PPD型還是PPT型人參皂苷，總體趨勢是糖基越少SIRT1激活活性越強。現代研究表明，SIRT1尤其是SIRT3與線粒體的能量代謝密切相關，此與人參傳統功效的“大補元氣”一致，提示其可能是人參延緩衰老的作用物質。普通人參皂苷向稀有人參皂苷的轉化，改變了普通人參皂苷的活性[16]。如在臨床上，更善于用紅參治療癌癥。人參經過煎煮，G-Rg3含量大幅上升，G-Rg3已應用于臨床治療癌癥。

稀有人參皂苷的作用也是多方面的，但近年在癌癥、心腦血管疾病、肺纖維化疾病以及延緩衰老等方面的研究相對較多[2，17-21]，有了相關的抗癌產品。構效關系研究[22-23]表明，某些稀有人參皂苷的抗癌細胞增殖大致有如下趨勢：G-Rk2≈G-Rh3>G-Rh2>G-Rk1≈G-Rg5>G-Rg3>G-Rh1，而Δ20，21PPD≈Δ20，22PPD>Δ20，21PPT≈Δ20，22PPT。有關不同稀有人參皂苷抗不同癌細胞增殖，資料公布的上海藥明康德合同研究組織(Contract Research Organization；CRO)測試結果見表4，具有一定的先導性。對人參地上部分化學物質的研究[12，22，24-27]提示含有更豐富的稀有人參皂苷。

人參方藥熱水煎煮，由水分子提供的活化能使人參皂苷化學結構發生變化，產生的稀有人參皂苷化學結構多樣性更豐富，體現了人參生物活性的多樣性。從對紅參化學成分的研究[4，7，21]，也佐證了人參水煎煮的科學內涵，而與用70%乙醇水溶液提取具有明顯的區別[28]。

表4 上海藥明康德CRO測試的某些稀有人參皂苷的細胞毒活性結果 μmol·L-1