基于多成分含量測定及色譜指紋圖譜技術提升白術藥材質量標準△

劉青，申潔，肖蘇萍，郭凱，何春年*，王繼永*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草藥物質基礎與資源利用重點實驗室，北京 100193；3.中國中藥有限公司，北京 100195

白術藥材來源于菊科植物白術AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，其味苦、甘，性溫，歸脾、胃經，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，常用于治療脾虛、腹脹、胎動不安等病癥[1]。始載于《神農本草經》，為上品藥材，是著名的道地藥材“浙八味”之一。在我國，白術的主要產區為浙江、四川、安徽、湖北、湖南等地，以栽培為主，其中浙江於潛所產白術的品質最佳，故又稱其為“於術”[2]。目前，從白術中分離出超過79種化學成分，包含倍半萜類、三萜類、多糖類、黃酮苷類以及多炔類等化合物[3]，其中倍半萜類是白術最重要的一類化合物，以揮發性成分白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ以及蒼術酮為主[4]。現代藥理學研究表明，白術具有多種藥理作用，如改善胃腸功能[5]、利尿、抗炎癥[6-7]、抗抑郁[8]、抗腫瘤[9]、增強免疫功能[10]等活性，其中白術內酯類是其藥理活性作用的重要成分。

白術為常用中藥材，具有廣泛的應用，但迄今其質量標準尚不完善。《中華人民共和國藥典》2015版中，僅從顯微鑒別、薄層色譜、色度、水分、總灰分以及二氧化硫等方面對白術藥材質量進行控制[1]，并沒有規定含量測定和指紋圖譜兩項。雖然已有白術含量測定和指紋圖譜的研究報道[11-13]，但并沒有明確提出白術內酯等指標成分的含量限度和建立特征圖譜。本研究系統地收集主要產區7個省市共38批白術藥材，建立了白術藥材的含量測定和化學色譜指紋圖譜評價方法，提出其主要活性成分白術內酯I～Ⅲ的含量限度以及白術藥材特征色譜峰，為白術藥材質量標準的提升和完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200 HPLC(G1322A型在線脫氣機、G1311A型液相泵、G1329A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315B型DAD檢測器、Agilent色譜工作站)；AL204型梅特勒-托利多萬分之一電子天平；超純水儀(Millipore公司)；KQ5200DE型超聲波清洗儀(江蘇省金壇市宏凱儀器廠)。

1.2 試藥

白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(中國食品藥品檢定研究院，純度均為99.9%，ID分別為3YQB-LYKQ、XQS8-HYPC、AVAL-RVEQ)；乙醇、甲醇(分析純，北京化工廠)；超純水(Millipore)；乙腈(色譜純，Honeywell)。

38份白術藥材粉末來源于浙江、湖南、湖北、四川等多個產地。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

稱取白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品各約10 mg，精密稱定，置于10 mL的容量瓶中，乙醇溶解并定容至刻度，得白術內酯儲備液，其中白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ質量濃度分別為1.02、1.04、1.05 mg·mL-1。分別取上述白術內酯儲備液各1 mL，置于10 mL的容量瓶中，加入乙醇定容，即得白術內酯的混標溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

稱取白術藥材(批號：DC7131)粉末約1 g，精密稱定，置于50 mL的容量瓶中，加入40 mL甲醇，搖勻，在35 ℃下，超聲提取30 min，放至室溫，用甲醇定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得到供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，洗脫程序為0～5 min，5%～60%B；5～20 min，60%～80%B；20～25 min，80%～95%B；25～30 min，95%～100%B；30～35 min，100%B。流速為1 mL·min-1，進樣量為20 μL，柱溫為35 ℃，檢測波長為220、280 nm，對照品及白術藥材HPLC圖見圖1。

注：A、C.對照品；B、D.白術藥材；1.白術內酯Ⅲ；2.白術內酯Ⅰ；3.白術內酯Ⅱ。圖1 白術內酯對照品及白術藥材HPLC圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍 將白術內酯的混標溶液用乙醇按不同的倍數稀釋，得到6份不同質量濃度的混標溶液，其中白術內酯I的質量濃度分別為4.08、8.16、16.32、26.52、51、81.6 μg·mL-1；白術內酯Ⅱ的質量濃度分別為4.16、8.32、16.64、27.04、52、83.2 μg·mL-1；白術內酯Ⅲ的質量濃度分別為4.2、8.4、16.8、27.3、52.5、84 μg·mL-1。上述6份混標溶液按2.3項的色譜條件進行檢測，并以色譜峰面積對白術內酯的濃度進行線性關系分析。白術內酯 Ⅰ：Y=83.073X+16.271，r=0.999 4；白術內酯 Ⅱ：Y=95.97X-47.587，r=0.999 3；白術內酯 Ⅲ：Y=52.241X+30.499，r=0.999 7。結果表明，白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在4.0～84.0 μg·mL-1線性關系良好。

2.4.2 檢測限與定量限 將混標溶液用乙醇進一步稀釋，按2.3項的色譜條件進行檢測，計算不同濃度下的信噪比(S/N)。信噪比(S/N)為3時，用于檢測限的考察；信噪比(S/N)為10時，用于定量限的考察。白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的檢測限分別為0.089、0.104、0.168 μg·mL-1；定量限分別為0.163、0.208、0.263 μg·mL-1。

2.4.3 精密度試驗 按2.2項下制備供試品溶液，并按2.3項的色譜條件檢測，連續進樣6次。結果顯示，白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積的RSD值分別為1.50%、1.51%、1.23%；保留時間的RSD值分別為0.6%、0.74%、0.62%，可見儀器的精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 按2.2項制備供試品溶液，分別于0、1、5、12、18、24 h，6個不同的時間點進樣檢測，結果白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積的RSD值分別為1.39%、1.94%、1.39%，可見24 h內白術供試品溶液較為穩定。

2.4.5 重復性試驗 取同一批次(批號：DC7131)的白術樣品粉末6份，按2.2項制備供試品溶液，并分別按2.3項的色譜條件進行檢測。白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積的RSD值分別為0.97%、2.08%、1.33%，結果表明測定方法具有良好的重復性。

2.4.6 加樣回收率試驗 稱取白術樣品粉末(批號：DC7131)約0.5 g，精密稱定，置于25 mL的容量瓶中，稱取6份；分別精密加入白術內酯I溶液(102 μg·mL-1)1.3 mL；白術內酯Ⅱ溶液(104 μg·mL-1)0.8 mL；白術內酯Ⅲ溶液(105 μg·mL-1)1.6 mL。按上述測定方法進行分析，計算加樣回收率，結果白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的平均加樣回收率分別為101.9%(RSD=3.34%)、107.55%(RSD=3.95%)、105.3%(RSD=3.50%)，符合《中華人民共和國藥典》2015版中對加樣回收率的要求。

2.5 樣品含量測定

采用2.2項供試品溶液的制備方法與2.3項的色譜檢測條件對自不同產地的38份白術樣品進行提取與檢測，計算白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量，測定結果見表1。白術內酯Ⅰ平均質量分數為(0.101±0.044)%，以湖南和四川產較高，安徽產最低；白術內酯Ⅱ平均質量分數為(0.028±0.021)%，以湖南產最高，河北產最低；白術內酯Ⅲ平均質量分數為(0.041±0.045)%，以湖南和四川產較高，安徽、河北和浙江產均較低。其中湖南和四川兩個產地的3種內酯成分含量均較高，而道地產區浙江白術的含量居于中等或較低。

表1 白術藥材含量測定結果及方差分析 %

注：a、b、c為Duncan表示值，字母不同表示差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5.1 基于3種白術內酯含量的PCA分析 對浙江、四川等不同產地的38份白術中3種白術內酯含量數據進行PCA分析，結果表明，不同產地的白術具有較好的分離趨勢(R2X=0.858，Q2=0.148)，見圖2A。表明不同產地來源的白術藥材具有較明顯的分離趨勢，提示不同產地的白術質量具有一定的差異性，其中傳統道地產區浙江產白術較為穩定。

注：A.3種白術內酯含量的PCA得分圖；B.系統聚類圖。圖2 3種白術內酯含量的PCA得分圖及系統聚類圖

2.5.2 基于3種白術內酯含量的聚類分析 以3種白術內酯含量為變量，采用組間聯接的聚類方法，以平方歐氏距離為測量方法，獲得38份白術樣品的聚類分析圖，見圖2B。系統聚類分析結果與PCA分析較為一致，浙江產地的白術除S7號樣品外，其余樣品與河北S16、S18號，湖南S13號以及湖北S14、S17號樣品同時聚為一類。安徽4份樣品與河北S17號、湖北S35號以及廣西S38號樣品聚為一類。四川與湖南產地的樣品之間交叉聚類，其中四川產地的S28、S32與湖南S11、S12、S23、S24號樣品聚為一類，而湖南S25號樣品與其余四川樣品聚為一類。

2.6 指紋圖譜分析

將220 nm下檢測的數據結果以AIA格式導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004 A版)，選定S1號樣品為參照色譜圖，采用平均數法，時間窗為0.1，經多點校正、圖譜自動匹配，以校正保留時間，使色譜峰對齊，生成對照指紋色譜圖，38份白術藥材的指紋圖譜疊加圖及對照指紋圖譜見圖3。從匹配結果中可以看出有21個共有峰。對比38份白術藥材的HPLC圖可發現，不同批次藥材的峰容量基本相似；由表2中峰面積RSD值可知，不同批次藥材共有峰的峰面積差異較大。根據各共有峰的峰形、保留時間、分離情況以及峰高等信息，本次研究選定以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10號色譜峰為白術藥材的特征峰。與對照品比較可知，1號色譜峰為白術內酯Ⅲ，5號色譜峰為白術內酯I，再根據出峰時間、峰高及參考文獻[15]等信息暫可確定9號峰為蒼術酮。由于9號色譜峰的對稱性好、峰較高，且與相鄰色譜峰達到基線分離，故選定9號色譜峰為參照峰(S)，分別計算對照指紋色譜圖中各共有峰的相對保留時間以及相對峰面積，其中，保留時間與峰面積數據均由《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004 A版)導出，結果見表2。

注：A.HPLC指紋圖譜疊加圖；B.對照指紋圖譜。圖3 38份白術樣品HPLC指紋圖譜疊加圖及對照指紋圖譜

表2 白術樣品特征圖譜共有峰的保留時間及峰面積

2.6.1 相似度分析 由中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004 A版)計算38份樣品的指紋圖譜的相似度，與對照指紋圖譜相比較，其相似度介于0.677～0.994。浙江白術的相似度除S4號樣品外，其余樣品相似度均大于0.95，進一步表明浙江產白術的穩定性較高。四川與湖南產地白術的相似度均低于0.95，四川白術相似度介于0.667～0.926，表明四川與湖南產地的白術差異性較大，可能與其白術內酯I、Ⅲ含量偏高有關，其中，S30號樣品的相似度最低，僅為0.667，可能是由7、8號色譜峰較低所引起。

2.6.2 不同產地白術的PCA分析 以共有峰的峰面積為變量，對38份不同產地的白術進行PCA分析，多個產地的白術大致分為3個區域(R2X=0.765，Q2=0.424)，見圖4A。湖南為一個區域，浙江與湖北為一個區域，四川與安徽為一個區域。湖南白術中S13、S15號樣品與其他樣品分離，二者相似度分別處于湖南白術相似度的兩個極值，S13樣品的相似度為0.942，與浙江樣品相似。湖北樣品除35號(相似度為0.899)外，其余3份樣品與浙江樣品相近。四川與安徽樣品之間相互交叉，表明兩產地白術具有較高的相似性。

2.6.3 不同產地白術的系統聚類分析 以共有峰的峰面積為變量，采用組間聯接的聚類方法，以平方歐氏距離為測量方法，獲得38份白術樣品的聚類分析圖，見圖4B。從聚類分析圖可看出，38份樣品被聚為2大類，一類主要包含四川與安徽產白術，另一類主要是浙江、湖南產白術。從系統聚類分析結果可看出，不同產地的白術藥材具有一定的地域性差異。整體來看，浙江樣品基本上聚為一類，表明浙江產白術內在質量的一致性較好。

注：A.共有峰峰面積的PCA得分圖；B.聚類分析圖。圖4 不同產地白術共有峰峰面積的PCA得分圖及聚類分析圖

4 討論

本文建立了簡便、快速的測定白術藥材3種內酯類成分的含量測定方法和指紋圖譜，能夠較好地評價和控制白術藥材的質量。本研究對提取溶劑及用量進行考察，比較了不同體積的甲醇、70%乙醇以及乙醇溶劑的提取效果，確定以50 mL甲醇超聲提取一次為樣品提取方法。相比參考文獻[14]使用70%乙醇溶液提取兩次，方便快捷。

指紋圖譜與含量測定方法是中藥材常用的質量控制方法。本實驗測定了白術藥材中的3種白術內酯含量，同時建立了白術藥材的特征圖譜。38份白術藥材的指紋圖譜中有21個共有峰，根據色譜峰的峰形、分離情況等選定其中10個峰作為白術的特征峰，為白術藥材的鑒別和質量穩定性提供評判依據。從含量測定結果中可看出，白術內酯Ⅲ的含量較低且差異性較大，若以《香港中藥材標準》白術內酯Ⅲ的含量限度(不低于0.019%)為檢測標準時，則本實驗的38份樣品中有20份是不合格的，即便是道地產區浙江白術也僅有1份樣品的白術內酯Ⅲ高于0.019%，顯然，以白術內酯Ⅲ不低于0.019%為標準控制白術質量是值得商榷的，有待進一步研究。

為了更充分地反映不同來源白術內在質量差異性，本文以38份白術藥材中3種白術內酯含量和指紋圖譜共有峰數據為因子，采用多元統計分析(聚類分析與PCA分析)進一步比較。結果均顯示，產地是影響白術藥材內在質量差異的重要因素，不同來源白術藥材內在質量差異較大，所建立的含量測定方法和指紋圖譜技術能夠較準確反映藥材質量，且兩者結果較為一致。從統計分析可看出浙江產區的白術具有較好的一致性，且浙江為白術的道地產區，故選用浙江產地的白術樣品對3種白術內酯的最低含量限度進行探討。以每種成分平均質量分數的80%作為最低含量限度。浙江白術樣品共12份，其白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的平均質量分數分別為0.103%、0.017%、0.014%，計算得出白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的最低質量分數限度分別為0.082%、0.014%、0.013%。12份樣品的白術內酯Ⅰ質量分數均高于0.082%，10份樣品的白術內酯Ⅱ質量分數高于0.014%，由于白術內酯Ⅲ質量分數差異性較大，僅有3份樣品的白術內酯Ⅲ質量分數高于0.013%，故白術內酯Ⅲ最低含量限度仍需進一步探討，其中0.013%可為進一步的研究提供參考。