星點設計-響應面法優選苦參總生物堿水提醇沉工藝

覃輝

湖北省荊州市中心醫院 藥學部，湖北 荊州 434020

苦參為豆科植物苦參SophoraflavescensAit.的干燥根，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿的功效。臨床多用于熱痢、便血、黃疸尿閉、赤白帶下、陰腫陰癢、濕疹、濕瘡、皮膚瘙癢、疥癬麻風；外治滴蟲性陰道炎等[1]。苦參主要含苦參堿、槐定堿、氧化苦參堿、羥基苦參堿等多種生物堿類成分[2]，而以上各種藥理活性的發揮很大程度上依賴于苦參中所含的總生物堿類成分[3-4]。故采取較好的工藝參數條件，將苦參中總生物堿類成分盡可能地從苦參飲片中提取出來，對于苦參藥用資源的進一步開發利用有著積極的意義。仝燕等[5]的研究表明，水煎煮提取法對苦參總生物堿提取效率相對更高，但經水提取后的提取液包含了大部分水溶性雜質，如多糖類。結合涂瑤生等[6]的研究結果可知，65%左右的乙醇對苦參總生物堿具有較好的選擇性。故本研究充分結合上述二者各自的優點采用水煎煮法提取苦參總生物堿，結合醇沉法對提取物進行純化，獲取其最佳提取工藝，以總生物堿得率和干膏得率的加權評分值為響應，結合響應面法優化苦參總生物堿的提取工藝，通過液料比、提取時間、醇沉濃度等因素水平考察及多因素間的重疊交互作用考察，綜合評判苦參總生物堿提取率和干膏得率，為苦參中總生物堿提取工藝的優化及其開發應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

水浴鍋(天津泰斯特，XMTD-2M)；電熱套(天津泰斯特-IB)；分光光度計(北京通用儀器，TU-1221)；電子秤(上海萬寶，ACS-30)；旋轉蒸發器(上海亞榮，RE-52A)。

1.2 試藥

苦參堿對照品(上海融禾醫藥科技有限公司，批號：10035，純度大于98%)；所用試劑均為分析純；水為純化水。

苦參購于武漢天濟中藥材有限公司，批號為171025，藥材經湖南中醫藥大學中藥鑒定教研室劉安平教授鑒定為豆科植物苦參SophoraflavescensAit的干燥根。

2 方法與結果

2.1 苦參提取物中總生物堿含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取經120 ℃干燥至恒質量的苦參堿對照品適量，以無水乙醇溶解，配制成每1 mL含10 mg的溶液作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取苦參飲片適量，精密稱定，加提取用量的水回流，按規定的時間提取(提取所用液料比、所需時間和乙醇沉淀濃度，分別按照表4進行)，提取液趁熱濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為1.15～1.20后，加入95%工業乙醇攪拌調節至醇沉所需濃度，靜止24 h，取上清液，濾渣再加95%工業乙醇醇沉12 h，合并兩次上清液置于旋轉蒸發儀中回收乙醇，得苦參流浸膏，流浸膏轉入蒸發皿中，以少量乙醇潤洗燒瓶，洗液轉入蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘3 h，干燥器中放冷即得干膏。取苦參干膏0.2 g，精密稱定，置于燒杯中，加入10 mL 2%鹽酸溶液，調pH 3～4[7-8]，濾過，液中加入5%NaOH溶液調節pH 10～11[7]，以三氯甲烷萃取3次，分段萃取(依次為濾液體積的1倍、1/2倍、1/2倍)，合并三氯甲烷層，水浴蒸干，殘渣加無水乙醇溶解，定容至10 mL，搖勻，作為供試液備用。

2.1.3 重復性試驗 取同一批苦參干膏粉(批號：1606001)5份，照2.1.2項下，自“取苦參干膏0.2 g，精密稱定，置于燒杯中”起依法操作，制備供試品溶液，按2.1.5項下方法測定，結果見表1。

表1 重復性試驗結果

2.1.4 加樣回收試驗 各取6份已知含量的同一批次(批號：1606001)苦參干膏粉，每份供試樣品約0.15 g，精密稱定。分別向各供試樣品中準確加入近等質量的苦參堿對照品，照2.1.5項下條件逐一進行測定。加樣回收率計算結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.1.5 總生物堿含量測定 取上述供試品5 mL，精密加硫酸滴定液20 mL，搖勻置水浴上加熱，使殘渣完全溶解并除盡乙醇，放冷加蒸餾水30 mL，甲基紅指示液4滴，用氫氧化鈉滴定液滴定至溶液顯微黃色，30 s不褪色即達到滴定終點，按下式計算苦參堿總生物堿含量。

(1)

(2)

其中：V總為樣品溶液的總體積，mL；V取樣為滴定時供試品的取樣體積，mL；VNaoH為氫氧化鈉滴定液的消耗體積，mL；T為氫氧化鈉滴定液相對總生物堿的滴定度，5.529 mg·mL-1。

2.2 干膏得率

取干燥至恒重的蒸發皿，精密加入流浸膏100 mL，水浴蒸干，于105 ℃烘3 h，干燥器中放冷，精密稱質量，計算即得。

2.3 苦參中總生物堿的優選提取工藝設計

2.3.1 試驗設計 通過對多個影響綜合評分因素全面考察之后，本研究最終選取液料比(A)、提取時間(B)、提取次數和醇沉濃度(C)等4個關鍵影響因素作為本次實驗研究的自變量，鑒于提取次數為非連續型變量，試驗設計過程中可不考慮該因素的回歸分析[8]，結合實際生產及有關文獻[7]，暫定提取次數為2次。依據Box-Behnken中心組合的設計基本原理，取液料比A(倍)、提取時間B(h)、醇沉濃度C(%)3個因素，每個因素下各設定低、中、高3個水平，依次賦值為-1、0、+1。實驗組中心組合設計因素和各自水平見表3，采用加權評分法計算苦參浸膏得率和總生物堿的得率兩者總權重評分，以總評分值為評價指標，按Box-Behnken中心設計方案進行試驗，結果見表4。

表3 Box-Behnken設計中心組合因素水平

表4 Box-Behnken試驗方案結果

注：總權重評分值=苦參干膏得率評分值+苦參總生物堿得率評分值；苦參干膏率評分值=(苦參干膏率測得值/苦參干膏率測得平均值)×40；苦參總生物堿提取率評分值=(苦參總生物堿提取率/苦參總生物堿提取率平均值)×60。

2.3.2 模型擬合與方差分析 運用Design-Expert設計軟件對表4中的試驗數據進行回歸分析，計算3個自變量提取液料比(A)、提取時間(B)和乙醇濃度(C)同應變量總權重評分值(Y)之間的線性擬合回歸方程：Y=109.44+6.64A+2.93B-3.76 C+2.07B-2.15AC-0.58BC-6.92A2-3.65B2-9.52C2。從軟件系統方差分析給出的結果可知：本實驗擬合度極為顯著(P=0.000 3<0.01)，表明本次建立的試驗模型在選定的因素范圍內具有較好的統計學意義；設計模型的平方和為F=1 273.31，表明該模型具有顯著性。回歸方程中自變量以A、C、A2、C2等對總權重評分(Y)的線性效應最為突出(P<0.01)，一次項即單因素中，以液料比(A)對因變量的總權重評分影響最為突出，醇沉濃度(C)次之；其中液料比(A)對總權重評分的影響為正相關，醇沉濃度(C)對總權重評分的影響為負相關；而提取時間(B)對總權重評分的影響差異不具有統計學意義；回歸方程二次項中以A2、C2對總權重評分的線性效應最為突出(P<0.01)，其中以乙醇濃度(C)的影響最為突出，液料比(A)影響次之；響應面模型方差分析結果見表5。

表5 響應面模型方差分析結果

本試驗模型擬合極顯著(P=0.000 3<0.01)、R2=0.963 5、失擬項P=42.41值>0.05表明，回歸方程擬合度高，試驗測定值與模型的預測值二者較為接近，模型不存在顯著失擬，故能夠應用該模型對該提取工藝進行響應面分析。將數據代入Design-Expert軟件運算，系統生成液料比、提取時間和乙醇濃度因素對于響應值的三維曲面，見圖1～3，響應值的等高線分別見圖4～6。

圖3 醇沉濃度、提取時間對響應值三維圖

圖4 提取時間、液料比對響應值等高線圖

圖5 乙醇濃度、液料比對響應值等高線圖

圖6 醇沉濃度、提取時間對響應值等高線圖

直觀對比以上3組曲面響應圖可知，自變量A(液料比)與自變量B(提取時間)的響應曲面三維圖像呈一個陡峭的曲面，故液料比與提取時間的交互作用對應變量Y(總權重評分的影響較大)；提取液料比(A)醇沉濃度(C)兩個交互作用對總權重評分的影響較小，圖1～3的均是向下開口的凸面，結合回歸方程可知，本次實驗所考察的范圍內存在響應值的最大值；等高線圖為圓形至橢圓形，響應面為高度卷曲而規則的曲面，表明自變量與因變量之間的函數關系不能完全采用一元線性方程描述，而采用多元線性方程則能夠更全面地表述液料比(A)、提取時間(B)、醇沉濃度(C)與總權重評分值(Y)之間的線性關系。

經過Design-Expert軟件統計數據分析，系統預測和推薦的最佳參考工藝為：液料比9.23倍、提取時間2.60 h，醇沉濃度70.72%，該工藝條件下理論最優評分可達112.89分，總生物堿提取率可達1.63%、干膏率達22.51%。為貼近工業實際操作，將該工藝參數調整為：液料比9倍量、提取時間為3 h、乙醇濃度為70%進行驗證實驗。

2.3.3 驗證實驗 準確稱取苦參飲片3份，每份100.0 g，按優選的工藝條件進行總生物堿提取，結果見表6。

表6 驗證實驗結果 %

由表5中數據可知，結果與回歸方程的預測值基本接近，從而更加證實了該數學模型預測的準確性，故采用中心組合星點設計-響應面法優化苦參中總生物堿提取工藝是具有實踐和理論可行性的。

3 討論

本次研究采用了星點-設計響應面中心組合法優化苦參中總生物堿提取工藝，對液料比、提取時間和醇沉濃度等自變量及自變量之間的交互作用進行考察。將響應面三維圖結合系統給出多元線性回歸方程發現，一次項中對苦參中總生物堿提取有極顯著性影響的主要是液料比和醇沉濃度，其中以液料比(A)對總權重評分的影響最大，醇沉濃度(C)次之；液料比(A)對總權重評分的影響為正相關，而醇沉濃度(C)對總權重評分的影響為負相關，從而提示醇沉濃度并不是越大越好，乙醇濃度在達到78%以后，總評分顯著下降；而提取時間(B)為不顯著的影響因素(P>0.01)，在一定范圍內可以適當調整以滿足生產需求即可。二次項中，以A2、C2對總權重評分的線性效應最為顯著(P<0.01)，其中以醇沉濃度(C)的影響最大、液料比(A)影響次之，從而提示醇沉濃度對浸膏的收率及浸膏中生物堿的含量有較大影響，是生產中應該監控的重要因素；響應面三維曲面圖提示，交互項中液料比(A)和提取時間(B)的交互作用對苦參總生物堿提取率有較大影響。

綜合本次實驗優化結果可知，提取液料比控制在8倍以上、提取時間2 h以上、乙醇濃度范圍在66%～78%時，總權重評分值均大于110分，說明66%～78%乙醇對苦參總生物堿具有良好的選擇性，實際操作時可根據生產需求進行合理選擇；考慮到工業上提取液料比大于10倍后，提取液的濃縮體積較大對提取、濃縮所需設備及耗能提出更高的要求；雖然單因素中醇沉濃度對總生物堿提取率影響雖占其次，但醇沉不需要額外耗能(乙醇可回收利用)，并且能夠沉淀大部分雜質成分，故在保障干膏率的基礎上可采取適當延長醇沉時間以提高苦參總生物堿提取率。提取時間為不顯著因素，同時考慮到工業上提取2次基本上滿足生產效益的需要，結合本次所優化的工藝參數，得苦參總生物提取的最優工藝條件為：液料比9倍量，提取2次、3 h/次，醇沉淀濃度為70%。