異甘草酸鎂注射液的穩定性研究△

鄭富香，徐艷霞，李超，王一丹，任曉亮

天津中醫藥大學 中藥學院，天津 300193

中藥注射劑的安全性、有效性和質量可控性，不僅是國家政策的需要，也是中藥注射劑本身發展的需要，與其他中藥劑型相比，注射劑具有生物利用度高、療效確切、作用迅速的特點[1]。異甘草酸鎂注射液是正大天晴藥業股份有限公司專利獨家生產的國家一類新藥[2-3]，由甘草中的主要成分甘草酸，經旋光異構化后與鎂離子成鹽形成[4]。甘草酸是評價甘草藥材、成藥質量、制劑穩定性和制訂藥品質量標準的最重要的指標性成分，存在α和β兩種立體異構體，而異甘草酸鎂為18α甘草酸，在體內更易與受體蛋白和類固醇激素的靶細胞受體結合而發揮改善肝功能的作用[5]，是一類復合功能性的抗炎藥物，具有肝臟靶向性[6]。現代藥理研究表明，在不同肝毒劑引起的肝損傷模型中，異甘草酸的抗肝損傷作用明顯優于天然甘草酸[7]。研究發現，甘草酸及其衍生物都具有抗病毒、保護肝臟、調節細胞免疫等作用[8]，這是一種肝細胞保護劑，療效優于天然異構體，而且安全性好的高純度藥物[9]。藥效實驗顯示，異甘草酸鎂對D-氨基半乳糖引起的大鼠急性肝損傷有防治作用；對CCl4引起的大鼠慢性肝損傷也有改善作用[10-11]。本實驗通過在不同條件下對異甘草酸鎂注射液的穩定性及配伍進行考察，為臨床和生產應用提供參考。

1 材料

高效液相色譜儀(SHIMADZU LC-20AT)；BT125D型十萬分之一天平、PB-10型pH計(德國賽多利斯科學儀器有限公司)；KH3200B型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

異甘草酸鎂注射液(規格：10 mL：50 mg，批號：151126204，正大天晴藥業集團股份有限公司)；異甘草酸鎂對照品(由正大天晴藥業集團股份有限公司提供，純度≥98%)；0.9%氯化鈉注射液(批號：B151203062，山東科倫藥業有限公司)；5%葡萄糖注射液(批號：D151113042，山東科倫藥業有限公司)；10%葡萄糖注射液(批號：D151103101，山東科倫藥業有限公司)；乳酸環丙沙星注射液(批號：D151115246，石家莊藁城區四海藥業有限公司)；HPLC分析用乙腈為色譜純，氫氧化鈉、磷酸二氫鉀等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 檢測波長的選擇 采用UV-Vis分光光度計在190～760 nm對異甘草酸鎂對照品、異甘草酸鎂注射液進行掃描，測得最大吸收波長，且在該波長下進行HPLC分析時，制劑中其他成分對異甘草酸鎂測定無干擾，最終選擇252 nm波長下進行研究。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：252 nm；流動相：磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)-乙腈(78∶22)；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：1 mL·min-1，色譜圖見1～2。

圖1 異甘草酸鎂對照品HPLC圖

圖2 異甘草酸鎂注射液HPLC圖

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取異甘草酸鎂對照品50.00 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻即得。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密量取異甘草酸鎂注射液1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻即得。

2.2.3 磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)的配制 精密稱取磷酸二氫鉀6.8 g，純水溶解，加入0.1 mol·L-1NaOH溶液約395 mL，加水至1000 mL，混勻，過0.45 μm微孔濾膜，超聲脫氣備用[12]。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密稱取異甘草酸鎂對照品1.25 mg，置于5 mL棕色容量瓶中，配制質量濃度為250 μg·mL-1的溶液，并逐級稀釋質量濃度為200、150、100、50、25、10、5、1 μg·mL-1的溶液，搖勻。按2.1.2色譜條件，分別注入HPLC中，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標，異甘草酸鎂濃度為橫坐標。結果顯示，異甘草酸鎂的線性回歸方程為：Y=10 390X-24 388(r=0.999 6)，說明在1～200 μg·mL-1線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取高(150 μg·mL-1)、中(50 μg·mL-1)、低(10 μg·mL-1)3個質量濃度的異甘草酸鎂對照品溶液，分別重復進樣6次，測定其峰面積，計算異甘草酸鎂的濃度，計算RSD分別為0.345%、1.06%、2.2%，表明精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 將一定濃度的樣品溶液在上述色譜條件下于間隔時間為0、2、4、6、8、10、12、24 h重復進樣，測定其峰面積，計算RSD值為1.5%，表明穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 按2.2.2項配制6份供試品溶液，進樣測定其峰面積，計算異甘草酸鎂的濃度，計算RSD為1.5%，表明重復性良好。

2.3.5 加樣回收率的考察 精密量取100 μL的異甘草酸鎂注射液于10 mL容量瓶中，加入100 μL的對照品溶液，純水定容，混勻，平行制備6次，進樣測定其峰面積，計算異甘草酸鎂的濃度，測得加樣回收率分別為97.5%、95.2%、100.4%、96.4%、96.7%、98.9%，RSD為1.8%。

2.4 異甘草酸鎂注射液在不同pH條件下的降解動力學研究

用磷酸二氫鉀、氫氧化鈉和鹽酸制備pH分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的緩沖溶液，精密量取異甘草酸鎂注射液200 μL，置于10 mL的棕色容量瓶中，分別用上述緩沖溶液定容至刻度，得到異甘草酸鎂在不同pH條件下的樣品溶液，間隔一定的時間(0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 h)取樣，HPLC測定溶液中異甘草酸鎂的殘余濃度(Ct)，根據化學動力學規律，百分剩余濃度的對數ln(Ct/C0)為縱坐標，時間t為橫坐標，繪制降解曲線，見圖3。

ln(Ct/C0)=-Kt

(1)

其中Ct為t時刻藥物濃度，C0為初始時刻藥物濃度，t為反應時間，K為反應速率常數。

為研究注射液降解的機理、影響其降解的因素及預測注射液的有效期，通過化學反應動力學方法計算降解速率常數K和半衰期(t1/2)，結果見表1。

圖3 異甘草酸鎂注射液在不同pH條件下的降解動力學曲線

pHK(h-1)t0.5/ht0.9/h10.142 004.880 20.742 9620.137 005.058 30.770 1030.012 0057.750 08.791 6740.000 0513 860.000 02 110.000 00

結果顯示，異甘草酸鎂注射液在強酸(pH 1～2)條件下有明顯的降解，其他pH條件下(pH 5～12)基本無降解，與pH 4曲線圖近似，故沒有在圖表中體現，表明異甘草酸鎂注射液在強酸條件下不穩定，提示不宜在此條件下提取、保存、運輸。

2.5 異甘草酸鎂注射液在不同溫度下的降解動力學研究

2.5.1 異甘草酸鎂對照品 精密量取異甘草酸鎂對照品溶液200 μL，置于10 mL棕色容量瓶中，用超純水定容，混勻，制得樣品溶液。并用HPLC測定溶液中異甘草酸鎂濃度C0。將樣品溶液密封，分別置于溫度為70、80、90 ℃的恒溫水浴鍋中，間隔0、0.5、1、2、3、4、5、6 h取樣10 μL，測定溶液中異甘草酸鎂濃度Ct，以ln(Ct/C0)對t作圖，得到溫度對異甘草酸鎂降解速率的影響，結果見圖4。

圖4 異甘草酸鎂對照品在不同溫度下的降解動力學曲線

根據阿侖尼烏斯方程(lnK=lnA-Ea/RT)，(其中Ea為活化能)計算在70～90 ℃條件下，異甘草酸鎂對照品的降解活化能(Ea)=24.33 kJ·mol-1。

2.5.2 異甘草酸鎂注射液 精密量取異甘草酸鎂注射液200 μL，置于10 mL棕色容量瓶中，用超純水定容，混勻，制得樣品溶液。并用HPLC測定溶液中異甘草酸鎂濃度C0。將樣品溶液密封，分別置于溫度為70、80、90 ℃的恒溫水浴鍋中，間隔0、0.5、1、2、3、4、5、6 h取樣10 μL，測定溶液中異甘草酸鎂濃度Ct，以ln(Ct/C0)對t作圖，結果見圖5。

根據阿侖尼烏斯方程(lnK=lnA-Ea/RT)，計算在70～90 ℃條件下，異甘草酸鎂注射液的降解活化能(Ea)=20.99 kJ·mol-1。

結果顯示，異甘草酸鎂注射液和對照品溶液的降解速率隨溫度的升高而加快，且注射液的降解速率對溫度變化稍不敏感，較穩定。

2.6 異甘草酸鎂注射液在不同離子條件下的降解動力學研究

精密量取異甘草酸鎂注射液100 μL，置于10 mL棕色容量瓶中，分別用不同離子儲備液(0.1 mol·L-1NaCl、CaCl2、CuCl2、AlCl3溶液)定容至刻度，混勻，制得待測樣品，以純水作對比，用UV-Vis分光光度計在0、0.5、1、3、5 h內測定異甘草酸鎂注射液的吸光度值并觀察溶液外觀變化，變化曲線見圖6。

圖6 吸光度變化曲線圖

結果顯示，隨靜置時間增加，各待測液顏色無明顯變化，且溶液澄清，無可見異物，與純水比較，加入Al3+后注射液的吸光度有明顯變化，Cu2+使注射液的吸光度明顯降低，表明異甘草酸鎂注射液在不同離子條件下未發生降解，只是與不同金屬離子發生了絡合反應導致吸光度發生變化，這可能與異甘草酸鎂三萜骨架結構有關，此研究主要的目的是為注射液的保存、運輸過程提供參考。

2.7 與臨床常用注射液配伍后的穩定性試驗

2.7.1 與不同溶媒配伍 按臨床常用濃度，取異甘草酸鎂注射液3支，分別注入5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液、0.9%氯化鈉注射液，定容至10 mL，振蕩搖勻，室溫下放置。

2.7.1.1 pH值檢查 取上述溶液，分別于0、0.5、1、3、5 h觀察溶液外觀變化并測定pH，結果各配伍液在5 h內均澄明，顏色無明顯變化，無可見異物，pH變化曲線見圖7。

圖7 pH值變化曲線圖

2.7.1.2 含量測定 取上述溶液，采用紫外分光光度計分別于0、0.5、1、3、5 h下測定，可見異甘草酸鎂與3種注射液配伍后的吸光度無顯著變化，吸光度變化曲線見圖8。

圖8 吸光度變化曲線圖

結果表明，異甘草酸鎂注射液與5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液、0.9%氯化鈉注射液配伍后5 h內外觀、pH值、含量、可見異物等考察指標無明顯變化，說明異甘草酸鎂注射液可與3種注射液配伍且保持穩定。

2.7.2 與乳酸環丙沙星注射液配伍 乳酸環丙沙星注射液屬于喹諾酮類抗菌藥，主要用于治療胃腸道和泌尿系感染等[13-14]，環丙沙星為合成的第三代喹諾酮類抗菌藥物，具有殺菌力強、抗菌譜廣、在組織中易于分布等特點，在臨床上應用日益廣泛，其不良反應也就隨之不斷增加[15]。

無菌注射器抽取2 mL乳酸環丙沙星液體備用，將1支異甘草酸鎂注射液加入0.9%氯化鈉溶液100 mL中，混勻稀釋備用。分別用5 mL無菌注射器取以上藥液各1 mL置于干燥試管中，兩者混合后立即出現白色渾濁，呈絮狀液；放置2 h后，仍呈白色渾濁絮狀液。

結果表明，乳酸環丙沙星與異甘草酸鎂注射液混合后，生成了白色渾濁的絮狀液，兩種藥物之間有相互作用，存在藥物配伍禁忌。

3 討論

本實驗所采用HPLC測定重復性、精密度、穩定性及加樣回收率較好，方法準確、可靠。

配伍穩定性實驗表明：異甘草酸鎂注射液與5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液、0.9%氯化鈉注射液3種輸液配伍后，5 h內外觀、pH、含量等考察指標無明顯變化，建議臨床配伍使用。乳酸環丙沙星與異甘草酸鎂注射液混合后，生成了白色渾濁的絮狀液，表明兩種藥物之間有相互作用，存在藥物配伍禁忌，該實驗結果提示，醫護人員在臨床上聯合使用這兩種藥物時，應間隔用藥。

異甘草酸鎂注射液在強酸條件下(pH 1、2)不穩定，分析原因可能是異甘草酸鎂自身特殊結構的影響，在強酸條件下羥基脫水，增加雙鍵結構，再經雙鍵移位，分子縮合等原因，在高溫條件下不穩定、發生降解，可能與結構中官能團被破壞有關，故不宜在此條件下提取、保存、運輸。金屬離子Ca2+和Na+對注射液穩定性影響很小，而Al3+和Cu2+對其穩定性影響很大，分析原因可能是Al3+和Cu2+的空間結構和電子排布及發生絡合反應的影響，應用過程中應注意，以上具體作用機制還需研究者繼續探討。