油菜種子含油量影響因素及調控綜述

劉蕊 王寧寧 王玉康

摘要：作為世界重要油料作物之一的油菜（Brassica napus），其種子油不僅在食用植物油領域占據重要地位，在化工產業和生物能源領域也發揮舉足輕重的作用。本文主要綜述油菜種子含油量影響因素及調控方面的研究進展，提出運用基因工程提高油菜種子油含量的策略，以期為油菜含油量的大幅度提高提供參考依據。

關鍵詞：油菜;含油量;影響因素和調控;基因工程

中圖分類號： S565.401? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0025-05

油菜是重要的油料作物，在我國年產量已達1 400萬t，其中國民消費量達600多萬t，占食用植物油總量的20%左右[1]。油菜成熟種子中大約含45%的儲藏油，25%的蛋白質和10%的可溶性糖。種子油含量是重要的農藝性狀，也是油菜品質的關鍵決定因素，隨著油菜種子油在食品和非食品應用方面需求量的不斷增加，如何提高油菜種子油含量受到人們的廣泛關注。然而到目前為止，油菜種子油含量影響因素的作用機制以及油份積累的分子調控機制研究得還不夠透徹。本文主要針對油菜種子含油量在影響因素和調控方面已取得的研究進展進行綜述。

1 油菜種子油生物合成和積累

植物種子油主要以三酰甘油（triacylglycerols，簡稱TAG）的形式進行儲存，種子油的生物合成可分為脂肪酸（fatty acid，簡稱FA）合成和三酰甘油合成兩大階段[2]。在油菜種子中，三酰甘油的合成量占種子質量的60%[3]，對種子含油量貢獻很大。三酰甘油的合成需要眾多亞細胞結構多條途徑共同作用，許多調節基因和酶基因參與這個過程[4-5]，任何一類酶的表達或調控出現問題都會影響種子含油量[6]。脂肪酸在質體中的合成主要包含飽和脂肪酸從頭合成、脂肪酸碳鏈延長以及不飽和脂肪酸合成[7]，質體FA的合成途徑決定了種子油中酰基鏈長度和飽和度水平。脂肪酸合成底物乙酰輔酶A（acetyl-CoA）經過一系列反應生成含有12～18個碳原子的脂肪酸，接著在特異性硫酯酶作用下，催化含有酰基載體蛋白（acyl carrier protein，簡稱ACP）的脂肪酸從ACP上釋放出來，成為游離脂肪酸[8]，其在酰基輔酶A合成酶（acyl-CoA sythetase） 作用下又轉變為酰基輔酶A（acyl CoA），之后轉運至胞質或內質網[9-10]，胞質內的酰基輔酶A通過內質網上3-磷酸甘油酰基轉移酶（glycerol-3-phosphateacyltransferase，簡稱GPAT）[11]、溶血性磷脂酸酰基轉移酶 （lyso-phosphatidic acid acyltransferas，簡稱LPAAT）[12]以及二酰甘油酰基轉移酶（diacylglycerol acyltransferase，簡稱DGAT）[13]的作用在甘油骨架上連接脂肪酸合成TAG，儲存于亞細胞器油體內。

油菜種子油積累的分子機制目前還不是十分清楚，但種子油積累過程已有研究，其主要與種子形成有關。油菜開花后25～30 d種子油積累遲緩，30 d后高效聚積，40 d后積累速度減慢，種子成熟時期油含量最高。文均研究了甘藍型油菜種子發育過程中油脂積累動態變化，結果發現，快速積累時期為油菜種子油累積差異最顯著時期，也是不同品種油菜含油量產生差異的重要時期[14]。

2 影響油菜種子油合成及積累的因素及調控

2.1 油菜種子含油量的影響因素及調控

2.1.1 關鍵酶編碼基因的作用及調控 油菜含油量主要受其基因的影響，研究表明，油菜子代含油量與母體基因型有關，母體含油量與后代含油量呈正相關關系。在油菜種子油合成過程中關鍵酶編碼基因發揮重要作用，其對油菜種子油含量的影響主要依靠基因的表達并通過調節酶的活性來實現，這個過程涉及的基因主要包括催化脂肪酸鏈合成的關鍵酶基因乙酰輔酶A羧化酶基因（Acetyl-CoA carboxylase，簡稱ACCase）、脂肪酸硫酯酶A基因（Fatty acidthioesterase A，簡稱Fat A）、脂肪酸硫酯酶B基因（Fatty acidthioesterase B，簡稱Fat B）等以及與TAG組裝相關的關鍵酶基因GPAT、LPAAT 和DGAT等。已有大量研究表明，油菜含油量的提高可通過調節關鍵酶活性的方式進行，如合成脂肪酸的關鍵限速酶基因ACCase，在一定程度上其酶活性決定著油菜高油份的形成。1983年，Turnham等研究油菜授粉后發育的種子時發現，種子發育早期ACCase的活性明顯增強，種子油合成量急速增加，隨后酶的活性下降，種子油合成量也隨之降低[15]，ACCase活性與油菜種子含油量呈正相關關系。DGAT是合成TAG的關鍵編碼限速酶基因，其酶活性是油菜種子油含量的關鍵影響因素。DGAT有4種類型，其中對DGAT1、DGAT2這2種類型的研究較多。在甘藍型油菜中，過表達DGAT1會顯著增加種子油含量和種子大小。另外DGAT1的活性水平對TAG合成會產生實質性影響，當沉默油菜DGAT1基因后發現，該酶活性和種子含油量明顯下降[16]，而過表達低芥酸油菜DGAT1基因，DGAT1活性升高，產物與底物比率增加，經自上而下控制分析（TDCA），測定證實種子油含量也增加[17]。DGAT2主要影響后期油脂的轉化，對油菜高油份的形成作用不大。

2.1.2 轉錄調控因子 關鍵轉錄因子也會影響油菜種子含油量，其主要在調控油菜種子發育以及種子油累積方面起作用。研究表明，在轉錄因子的作用下激活或抑制種子油合成相關基因的表達可以提高種子含油量[18]。調控油菜種子含油量的轉錄因子主要有WRI1（WRINKLED1）、LEC1（LEAFY COTYLEDON1）、LEC2（LEAFY COTYLEDON2）、FUS3（FUSCA3）和ABI3（abscisic acid-insensitive 3）等。

直接調控脂肪酸和TAG合成的WRI1為AP2/EREBP家族成員[19]，2010年已在油菜中克隆出WRI1基因[20]，其存在多個拷貝，高表達于種子中，其他組織表達量相對較低。BnWRI1可以通過與GT1-element 或GCC-box結合或與二者均結合的方式將脂肪酸合成與光合作用結合起來，使得油菜種子含油量水平得以提高[21]。過表達甘藍型油菜中的WRI1會使種子油含量增加[22]，且油菜油脂積累與膜脂合成代謝的脂質穩態也會受其調控[23]。LEC1屬于NFY-B型CCAT-box結合轉錄因子家族，位于WRI1的上游，它能夠提高與脂肪酸合成有關基因的表達量，增加種子發育中油脂的累積量，從而影響含油量[13]。LEC1過表達于油菜中，種子油含量可增加7%～16%，若對其表達進行抑制，含油量則減少10%左右，但脂肪酸組成未發生顯著變化[24]。LEC2、FUS3和ABI3是植物特異性的B3結構域轉錄因子。LEC2也位于WRI1的上游，分別異位表達LEC1和LEC2，均能激活WRI1，所以在調控WRI1表達上LEC1和LEC2可能互不影響[25]。FUS3能調控種子發育和參與油脂積累，Elahi等對甘藍型油菜FUS3基因的B3結構域下游區域進行突變得到3個突變體，其蛋白質含量雖然得到提高，但角果數和種子含油量均降低，同時LEC1、LEC2、ABI3和WRI1等基因的表達也受到了影響，表達量均下降[26]。油菜種子成熟時期，在脫落酸響應途徑中，ABI3作為主要的調控因子發揮作用[27]。由于油菜種子中存在葉綠素會影響種子成熟和油含量，ABA依賴的轉錄因子ABI3可以調節保留種子綠色的基因，從而去除種子葉綠素，使種子發育和種子油合成積累得以順利進行[28]。這些轉錄調控因子除了發揮自己特有的功能外，還可以相互調節。在擬南芥種子成熟階段，關鍵調節因子FUS3、ABI3、LEC1、LEC2均可調控WRI1的表達[29-30]。這4個關鍵調節因子之間的調控可構成一個調控網絡，可以通過互作發揮作用，也可通過對代謝信號通路和激素進行調控發揮作用。LEC1和LEC2 能彼此調控，也可調控FUS3和ABI3的表達，ABI3對FUS3的表達起到正調控作用，FUS3 既可以自我調控，又可以調控ABI3的表達[31]。除此之外，還有一些轉錄調控因子也參與種子油的調控，如擬南芥中的MADS域轉錄調節因子AGL15可直接調控AFL家族ABI3、FUS3和LEC2的表達，其主要通過赤霉酸分解代謝途徑調控轉錄因子影響胚的發育[32]，油菜中MADS-box家族的AGL11轉錄調控因子與擬南芥的親緣關系極近，在種子發育以及種子油積累期間該基因都能夠高效表達，說明該轉錄調控因子對種子發育和種子油合成可能起到重要作用[33]。

2.1.3 具有調節功能的非編碼RNA分子 植物種子發育階段存在一些能以RNA方式調控基因表達的非編碼RNA分子。miRNAs是非編碼性sRNAs中的一類，其調控基因表達主要是通過轉錄后修飾的方式進行。Wang等使用甘藍型油菜開花后14、21、28 d的早期種子構建了3個小RNA文庫，使用高通量測序技術對miRNA的表達進行檢測，結果發現，一些miRNA可能直接調控脂肪酸生物合成功能基因的表達，還有許多miRNA間接調節脂肪酸生物合成過程，這些miRNA主要通過與大量的轉錄因子發生作用進行調控，這些結果揭示了miRNA可參與種子發育過程并在脂肪酸生物合成中發揮重要作用[34]。運用高通量測序技術還鑒定了甘藍型油菜種子不同發育過程中涉及脂肪酸和脂類代謝的miRNA及其靶轉錄物，結果顯示，589個miRNA可以被236個miRNAs所靶向，其中新型的miRNA有49個，保守的miRNA有187個;miRNA的靶轉錄物與乙酰輔酶A生成和碳鏈去飽和酶有關，可以調節極長鏈脂肪酸、β-氧化和脂質轉運以及代謝過程的水平，結果表明，miRNA可能在甘藍型油菜種子脂肪酸和脂類代謝中起重要作用[35]。

2.2 氣象因子對油菜含油量的影響

氣候環境對油菜種子油含量也會有不同程度的作用。Zhu等研究了油菜種子成熟過程中NIL-9和NIL-1這2個近等位基因系，在高溫條件下前者具有比后者更高的種子油含量，另外隨著溫度升高種子油含量下降，同時伴隨著許多與脂質代謝、赤霉素刺激反應、光合作用以及翻譯延伸等途徑相關基因表達量的下調[36]。高溫還會影響甘藍型油菜開花，會致其不育或結實不良等[37]。除溫度外，光照也會影響油菜種子含油量，一般油菜開花后30 d內，溫度在25 ℃條件下，光照度由900 lx增加到2 880 lx時，種子油含量可增加4.2%～4.7%[38]。油菜種子油含量也受到種植地海拔高度的影響，高海拔地域油菜種子含油量與低海拔地域相比明顯開高[39]。通常情況下，對于同一種油菜而言，種植地區隨著緯度的增加，油含量也逐漸上升。油菜種子成熟階段，土壤濕度適宜，晝夜溫差較大，光照度合適便于積累較多的種子油。最近有研究預測未來氣候條件會致使油菜種子油含量和品質下降，但是值得慶幸的是品種間差異表明，盡管氣候條件變化較大，仍然可以鑒定和開發具有特定有益基因的品種以保持種子油含量和品質的穩定[40]。

2.3 栽培因子與含油量的關系

播期、播種量、密度、肥力、耕作方式、植物生長調節物質等影響油菜種子含油量。適期早播，采用直播方式以適宜的播種量將種子均勻地播在適宜位置，且播深穩定，成苗率提高，采用毯苗機械移栽方式移苗，栽培密度適當加大，有利于種子含油量的提高。在油菜營養生長期接種蚯蚓油菜的單株莢果數增加了36.7%，單株種子產量增加了46.5%，全株種子產量增加了29.7%，單株產油量、全株產油量也得到提升，分別上升了37.4%、21.0%[41]。在油菜成熟時期，依據油菜種植地土壤性質以及需肥條件，選擇合適的肥料種類和用量補充營養元素對提高種子含油量大有裨益。譚太龍等研究了肥料單施和配合施用對油菜含油量的影響，若單獨施加鉀肥、磷肥、氮肥，其用量與油菜含油量均呈負相關關系，若合理配合施用對提高油菜含油量有幫助，另外施加硫肥對油菜含油量也存在影響，具體用量要按照油菜種植地硫含量合理施用[42]。若在氮、磷、鉀肥施加均衡情況下再施加硼肥，油菜含油量可顯著增加，繼續增施鋅肥則無明顯影響[43]。將植物生長促進菌株與高效植物定殖能力結合起來，并使其表達一系列植物生長促進性狀，應用于全球重要作物。促進植物生長的根際細菌已被提議用作可持續農業的環保生物肥料，其通過多種機制促進植物生長和健康，這些機制包括固氮作用、激素的合成、調節植物乙烯水平、溶解不可利用的土壤磷酸鹽以及通過小生境排斥抑制病原菌和產生抗微生物代謝物。活細菌生物肥料的應用可以增強甘藍型油菜作物在大田中的發育，作物高度、莖、葉和莢生物量增加，種子油含量提高[44]。在油菜角果成熟前噴灑催熟劑和植物生長調節劑乙烯利可促進角果成熟，便于油菜機器收割，這對油菜含油量無負面效應[45-46]，多次用1 mg/L萘乙酸噴灑處于正在發育中的角果也可增加油菜種子油含量[47]。杜雪研究發現，在油菜生殖生長階段，噴施多效唑會使單位面積產油量顯著增加[48]。在油菜收獲時期，要保證上部角果還未完全變黃的植株占到所有植株的80%左右才可收割[49]。

2.4 油菜種子休眠性對含油量的影響

油菜種子在成熟過程中會出現種子油含量先增加達到一個最高點，然后在即將收獲時又減少的情況，這對油菜種子最終的含油量會產生不良后果。甘藍型油菜在種子發育的脫水階段，發育中胚的主要儲存產物三酰甘油至少損失10%，在種子成熟末期油脂含量下降更為明顯[50]，且溫室栽培的甘藍型油菜在成熟時期油脂含量下降10%～14%，比田間種植的油料作物（甘藍型油菜和海甘藍為5%～13%）下降得略高一些[51-54]。

在收獲之前，若油菜植株角果開裂，種子休眠不完善導致種子萌發，將對種子含油量會產生不利影響，同時也會影響其他養分品質。β-氧化影響種子休眠，種子發育期間β-氧化的重要性由擬南芥中的kat2突變體所揭示，其導致3-酮酰基輔酶A硫解酶活性的喪失并且種子中油脂減少約30%[55]。突變體和野生型具有相似的整體植株生長和表型，油脂含量降低似乎是由發育中種子的變化而不是由植株生長的變化決定的[50]。制止收獲前植株上油菜種子的萌發，減少種子油消減可有利于油菜種子含油量的提高。

3 運用基因工程提高油菜種子含油量

油菜種子油合成與分解是一個復雜的動態平衡過程，在促進種子油積累的同時要減少其降解。使用基因工程來增加油菜種子油含量已有大量研究。目前常用的方法有3種：（1）過表達種子油生物合成途徑上的酶基因或轉錄因子可提高油菜種子含油量。如在甘藍型油菜中分別過表達GPDH、GPAT、DGAT、LPAAT這4個基因會使種子含油量提高12.57%～14.46%，且在甘藍型油菜中同時過表達BnGPDH、BnGPAT和ScLPAAT可以進一步提高油含量[22]。Wu等將油菜的BnWRI1基因過表達發現，種子發育過程中參與光合作用的基因BnCAB和種子油合成關鍵酶基因BnBCCP的表達均上調，最終使油菜種子油含量提高[21]。Elhiti等研究了BnSTM在種子儲存積累過程中的作用，結果發現，過表達BnSTM后種子油含量增加，而蛋白質和蔗糖含量不受影響，同時伴隨著誘導編碼促進脂肪酸合成轉錄因子（BnLEC1、BnLEC2、BnWRI1）基因的表達[56]。（2）運用RNAi等方法沉默基因，如沉默貯藏蛋白基因、轉錄基因等[57]。在種子成熟過程中使用RNAi抑制SUGAR-DEPENDENT1（SDP1）的表達，油菜種子油含量增加約8%，對種子影響相對較小[58]。丁全如構建了包含油菜2種主要種子貯藏蛋白基因的hpRNAi植物表達載體以及AP2-hpRNAi植物表達載體，轉入油菜中可分別抑制油菜種子貯藏蛋白合成和干擾AP2基因的表達，進而增加油菜種子含油量[59]。邢蔓等將ihpRNA植物表達載體導入湘油15號中，該載體含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC），T2代種子含油量與對照相比增加約10%[60]。（3）運用轉基因技術增加油菜種子含油量。向油菜中轉入玉米的C4型PEPC，讓其在油菜葉片中高效表達，增加其光合速率，最終增加了油菜種子油含量[61]。在油菜中異位表達酵母中的基因，該基因編碼3-磷酸甘油脫氫酶，結果顯示，種子發育過程中該酶活性和3-磷酸甘油含量均提高，最終油菜種子油含量提升[62]。王伏林等將異質型ACCase復合基因導入油菜中，油菜種子能夠特異表達該符合基因，對T2代轉基因油菜含油量進行檢測發現，其比對照提高了約5.7%[63]。運用基因工程技術增加油菜種子含油量已取得了一系列成果，為基因工程提升種子油含量奠定基礎，但還需深入研究種子油合成途徑，找出重要關鍵基因，并將其作為靶基因用于基因工程，提高油菜種子油含量。

4 結論與展望

多年來我國油菜產量和種植面積均處于世界領先地位，在油菜單產方面提高幅度更是顯著，但油菜的平均含油量與國外品種相比較低，油菜產業發展受阻，影響了國際競爭力，解析影響油菜種子油合成和積累的因素以及分子調控機制對提高我國油菜種子含油量至關重要。酶基因作用、氣象因子、栽培技術和種子休眠性等因素都會影響油菜種子含油量，其中關于種子休眠性的研究鮮有報道，如何通過有效控制收獲前油菜植株開裂角果內種子發芽，完善種子休眠機制來增加油菜種子含油量還需要進一步研究。而對于關鍵酶編碼基因的作用研究較多，運用基因工程技術過表達種子油生物合成途徑上的酶基因或轉錄因子，沉默儲藏蛋白基因、轉錄基因以及引入新基因快速提高油菜種子含油量的研究成果頗豐。

經過前人的不懈努力，油菜種子油合成機制的研究已逐漸明晰，也篩選出一些決定種子高油份的關鍵基因，提高油菜含油量的栽培技術已逐步得到改進，如何充分運用影響油菜種子含油量的因素和調控機制大幅度提高油菜種子含油量還有待進一步研究。

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