Cu2+脅迫對大豆生長和抗氧化酶活性的影響

張亞坤 宋鵬 潘大宇

摘要：植物體攝入過量的重金屬Cu2+會對植物產生毒害作用，為探討外施Cu2+對大豆幼苗的毒害機理，以齊黃35為試驗材料，采用盆栽法，以不同濃度（0、20、200、400 μg/g）Cu2+處理液進行脅迫，研究外源Cu2+脅迫對大豆丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶活性（超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶POD）和根莖干鮮質量（地上干鮮質量和地下干鮮質量）的影響。結果表明，隨著Cu2+脅迫濃度的增加，MDA含量呈現上升趨勢;對2種抗氧化酶的活性影響顯著，但活性影響方向不一致，顯著降低SOD活性，增強POD活性，各Cu2+處理下SOD活性與同期對照組（15 d）相比降低 1.90%～19.55%，POD活性與同期對照組（15 d）相比增強31.36%～49.45%;Cu2+脅迫顯著降低大豆幼苗地上干質量、地上鮮質量、地下干質量、地下鮮質量、總鮮質量、總干質量，與對照組相比，400 μg/g濃度的Cu2+脅迫分別下降了55.58%、64.79%、60.31%、85.42%、57.46%、74.79%。Cu2+脅迫引起丙二醛、抗氧化酶和根莖干鮮質量的顯著變化，抑制大豆幼苗的正常生長，丙二醛是Cu2+脅迫的重要表征指標，研究為大豆幼苗的Cu2+毒害機理提供依據。

關鍵詞：Cu2+脅迫;活性氧;抗氧化酶;生物量;大豆

中圖分類號： S565.101? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0089-04

Cu2+是植物體生長必需的微量元素，參與植物體電子傳遞和光合作用，在植物的正常生長發育過程中起著重要的作用，但植物組織中過量的Cu2+會對植物產生毒害作用。有研究報道，受到Cu2+毒害的植物植株增長減少、光合作用減弱、礦物質元素攝入量下降[1-3]。

植物體攝入過量的重金屬Cu2+會使植物活性氧（reactive oxygen species，簡稱ROS）的產生與清除失衡，導致植物體活性氧的積累進而抑制植物生長并對植物產生毒害作用。活性氧產生后，會使植物器官中的膜脂發生過氧化，產生過氧化產物丙二醛（malondialdehyde，簡稱MDA）[4]。Liu等在玉米和水稻中研究發現，高濃度的Cu2+能夠增加植物不同組織的丙二醛含量[5-6]。植物可通過增加抗氧化酶、在根中對重金屬進行螯合等協調機制承受一定程度的Cu2+脅迫[7-8]。這些協調機制中，抗氧化防御系統在降低植物Cu2+毒害方面起著重要的作用[9-10]。抗氧化防御系統通過相關酶促和非酶促清除系統的啟動，以減輕或消除活性氧積累對植物的傷害，酶促系統主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，簡稱SOD）、過氧化氫酶（catalase，簡稱CAT）、過氧化物酶（peroxidase，簡稱POD）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbata peroxidase，簡稱APX）和谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，簡稱GR），非酶促反應主要包括抗壞血酸（ascorbic acid，簡稱AsA）、類胡蘿卜素（carotenoid，簡稱Car）以及一些含巰基的低分子化合物等[11-12]。Shashi等在鷹嘴豆和甘藍型油菜中研究發現，Cu2+脅迫能夠增加抗氧化酶活性[13-14]。Liu等在玉米中研究發現低濃度的Cu2+脅迫增加過氧化物酶活性，高濃度的Cu2+脅迫降低過氧化物酶活性[5]。

近年來，隨著工業生產、礦井開采和城市活動使得農業水源和土壤中富集大量金屬Cu2+，Cu2+脅迫已成為導致作物減產和品質下降的主要因素之一[15]。本研究通過測定不同濃度Cu2+處理下大豆幼苗丙二醛含量、酶活性和生物量的變化，探討Cu2+對大豆幼苗生長和抗氧化酶的影響，以期為深入闡明植物耐Cu2+機理提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與生長環境

試驗品種為齊黃35（審定編號：國審豆No.2015005），于2016年10—12月在國家農業智能裝備工程技術研究中心小湯山國家精準農業示范基地（116.44°E，40.18°N）中進行盆栽培養。挑選顆粒飽滿、大小均一的大豆種子，用1% NaClO溶液消毒15 min，之后用去離子水沖洗3次，用吸水濾紙吸干水分，挑選完好無損的大豆種子種于盆中，盆中預先用水澆透，每盆種植10粒種子，種子上覆蓋3 cm厚的干土基質。花盆直徑25 cm，高20 cm，每個花盆裝入6 kg的土基質（土與育苗基質按比例混合）。盆土基質基礎肥力為有機質含量為52.6%，全氮含量為1.47%，速效鉀含量為 143 mg/kg，有效磷含量為13.1 mg/kg，pH值為5.5。20 d后挑選長勢一致的幼苗，每盆留苗4株，共24盆96株。試驗期間，溫室內溫度保持在15～25 ℃，相對濕度（RH）為60%～75%，日間光合有效輻射（PAR）為400～800 μmol/（m2·s）。

1.2 Cu2+脅迫處理

Cu2+脅迫參照GB 15618—1995《土壤環境質量標準》中3個等級標準值設置[16]。采用分析純CuSO4·5H2O制備濃度為0、20、200、400 μg/g的Cu2+處理液備用。試驗中設置4個Cu2+梯度（表1），每個梯度均設置6個平行試驗，即4個處理6個重復24盆盆栽大豆幼苗。

以上處理分別在Cu2+脅迫后5、10、15 d，摘取大豆幼苗頂部第3～5葉位完全成熟的葉片，立即帶回實驗室進行MDA含量和抗氧化酶（SOD、POD）活性測定。在Cu2+脅迫處理15 d進行生物量的測定。

1.3 測定指標和數據分析

1.3.1 MDA含量和抗氧化酶活性測定 MDA含量測定采用趙世杰等改進方法[17]。SOD活性測定采用NBT法（nitrotetrazolium blue chloride，氯化硝基四氮唑藍法）[18]，POD活性采用愈創木酚法[19]測定。指標測定時，每個處理6次重復，取平均值。

1.3.2 生物量測定 處理15 d后，不同處理下的大豆幼苗通過去離子水沖洗干凈，并用吸水紙吸干附著于樣品上的水分，用剪刀將大豆樣品分為地上和地下部分。用分析天平分別稱取大豆樣品地上部分和根系的鮮質量（g/株），然后于105 ℃下殺青0.5 h，再在80 ℃烘干至恒質量，分別稱取大豆樣品地上部分和根系的干質量（g/株）。

1.4 數據統計

采用Origin軟件制作圖形，SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），數據顯著性差異運用Duncans新復極差法進行多重比較（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 Cu2+脅迫對大豆幼苗MDA含量的影響

MDA含量隨時間的延長呈先升高后下降趨勢。不同Cu2+脅迫處理下大豆幼苗葉片MDA含量差異顯著，Cu2+脅迫能夠顯著增加大豆幼苗葉片MDA含量。由圖1可知，處理5 d，Cu2+脅迫濃度在200 μg/g下，大豆幼苗MDA含量與CK相比增幅較小，差異不顯著（P>0.05）;Cu2+脅迫濃度在 400 μg/g 下，大豆幼苗MDA含量顯著升高，與CK相比增加了62.76%。處理10 d，各Cu2+脅迫處理下大豆幼苗MDA含量與CK相比差異均達到顯著水平（P>0.05），20、200、400 μg/g 下MDA含量與CK相比分別增加了20.6%、54.85%、62.76%，其中Cu2+脅迫濃度在400 μg/g下MDA含量達到最大值7.2 mmol/g。處理15 d，各Cu2+脅迫處理下大豆幼苗MDA含量與處理10 d相比有所下降，但與CK相比，各處理均達到顯著水平（P>0.05），20、200、400 μg/g下MDA含量與CK相比分別增加了23.36%、56.53%、61.43%。MDA含量隨Cu2+脅迫濃度的增加而顯著增加，表明外施Cu2+能誘導大豆幼苗MDA含量的升高，MDA含量高表明細胞膜脂過氧化程度增加，植物細胞膜受到的傷害增大。

2.2 Cu2+脅迫對大豆幼苗抗氧化酶活性的影響

2.2.1 對大豆幼苗SOD活性的影響 隨著Cu2+脅迫濃度和時間的延長，Cu2+脅迫處理能夠顯著降低大豆葉片SOD活性（圖2-A）。處理5 d后，Cu2+脅迫濃度在400 μg/g下SOD活性與CK相比差異達到顯著水平（P>0.05），大豆幼苗SOD活性降低了19.07%，其他Cu2+脅迫濃度下SOD活性與CK相比差異不顯著。處理10 d，Cu2+脅迫濃度在20 μg/g下SOD活性與CK相比差異不顯著（P>0.05）;Cu2+脅迫濃度在200 μg/g和400 μg/g下SOD活性與CK相比差異達到顯著水平，與CK相比SOD活性分別降低了20.05%和 24.86%，其中Cu2+脅迫濃度400 μg/g下SOD活性最小，為116.96 U/g。處理15 d，各Cu2+脅迫濃度對大豆幼苗SOD活性的影響與處理10 d類似，Cu2+脅迫濃度在20 μg/g下SOD活性與CK相比降低了1.90%，但差異未達到顯著水平（P>0.05）;在200 μg/g和400 μg/g下SOD活性與CK相比分別降低了19.78%和19.55%。

2.2.2 對大豆幼苗POD活性的影響 隨著Cu2+脅迫處理時間的延長，Cu2+脅迫處理能夠顯著增加大豆葉片POD活性（圖2-B）。處理5 d，各Cu2+脅迫下大豆幼苗POD活性與CK相比差異不顯著（P>0.05）。處理10 d，各Cu2+脅迫下大豆幼苗POD活性與CK相比差異均達到顯著水平（P>0.05），Cu2+脅迫濃度在20、200、400 μg/g下SOD活性與CK

相比分別增加了25.61%、34.49%、42.4%。處理15 d，各Cu2+脅迫濃度對大豆幼苗POD活性的影響與CK相比差異均達到顯著水平（P>0.05），分別增加了31.36%、33.94%和49.45%，其中Cu2+脅迫濃度在400 μg/g下POD活性達到最大，為266.81 U/g。

2.3 Cu2+脅迫對大豆幼苗生長和生物量的影響

2.3.1 對大豆幼苗生長的影響 Cu2+處理對大豆幼苗造成的毒害癥狀較明顯，主要表現在莖稈和葉脈會呈現黃褐色毒害癥狀（圖3）。隨著Cu2+處理時間的延長毒害癥狀從植物形態學下端向上端蔓延，對葉片的毒害是從葉片與葉柄連接處開始向整個葉的主脈和側脈延伸擴展。Cu2+處理后10 d，CK與20 μg/g Cu2+脅迫濃度下大豆幼苗生長狀況類似;200 μg/g Cu2+脅迫濃度下大豆幼苗基部莖稈呈現黃褐色病斑，部分植株中部葉片由葉柄向主葉脈蔓延黃褐色病斑;400 μg/g Cu2+脅迫濃度下嚴重影響大豆生長，與對照組相比，莖稈纖細、植株矮小，Cu2+毒害蔓延至新生葉片，黃褐色病斑從主葉脈蔓延到側脈，嚴重的會覆蓋整個大豆葉片，大豆植株基部葉片嚴重畸形、萎蔫。

2.3.2 對大豆幼苗生物量的影響 由表2可知，Cu2+脅迫處理顯著抑制大豆幼苗的生長。Cu2+脅迫濃度在20 μg/g時，主要抑制大豆幼苗地上部分的生長，對幼苗地下鮮質量和總鮮質量的影響不顯著（P>0.05），與CK相比，對地上鮮質量、地上干質量、根干質量和總干質量影響顯著，分別減少了21.49%、32.39%、33.33%、33.61%。而Cu2+脅迫濃度在200 μg/g時，對大豆幼苗地上部分和地下部分生長均有抑制作用，且差異達到顯著水平，與CK相比地上鮮質量、地上干質量、地下鮮質量、地下干質量、總鮮質量、總干質量分別減少了 38.43%、54.93%、38.13%、70.83%、38.18%、62.18%。隨著脅迫濃度的增加，Cu2+脅迫對大豆幼苗地上和地下部分生長的抑制效果越明顯，Cu2+脅迫濃度在400 μg/g下，地上鮮質量、地上干質量、地下鮮質量、地下干質量、總鮮質量、總干質量最小，與CK相比分別減少了55.58%、64.79%、60.31%、85.42%、57.46%、74.79%。

3 討論與結論

銅作為植物正常生命活動所必需的微量營養元素，廣泛參與各種生命活動[20]。然而過量的銅含量將影響植物細胞代謝和離子平衡，對植物產生毒害作用，進而影響植物的正常生長[10，21]。正常情況下，植物體內存在活性氧清除系統，使植物在生命活動中產生的活性氧處于產生和消除的動態平衡，從而使植物免受活性氧傷害。當植物處理脅迫逆境時，活性氧動態平衡被打破，產生大量活性氧，促使植物脂膜和細胞器膜的嚴重過氧化，MAD含量升高，進而導致光合色素含量下降，影響植物的光合作用，因此MDA含量一定程度上能反映植物體活性氧的含量[22]。短時（5 d）低濃度的Cu2+脅迫20～200 μg/g與同期對照組相比，MDA含量變化不顯著，但隨著時間的延長（10～15 d），低濃度的Cu2+脅迫20～200 μg/g 將會引起MDA含量的顯著變化;而短時（5 d）高濃度的Cu2+脅迫400 μg/g與同期對照組相比，MDA含量差異達到顯著水平。這可能是因為短時低濃度Cu2+脅迫并未破壞植物體內活性氧動態平衡，但隨著脅迫時間的延長，Cu2+離子脅迫打破植物體內活性氧動態平衡，導致活性氧大量產生，MAD含量升高;而高濃度的Cu2+脅迫迅速破壞植物體內活性氧動態平衡，引起MDA含量的顯著升高。本研究中發現，隨著Cu2+脅迫處理時間的延長，MDA含量逐漸升高（圖1），類似的研究結論也在玉米[5]、水稻[6]、小麥[23]、棉花[24]、竹子[25]和油菜[14]中發現，因而膜脂過氧化可能是Cu2+毒害植物的重要途徑，而MDA是膜脂過氧化的產物，因此MDA是表征Cu2+毒害的重要指標。

本研究結果表明，Cu2+脅迫能夠顯著增強POD的活性，這與一些學者在玉米[26]、穿心蓮[27]的研究結果一致;低濃度的Cu2+脅迫對SOD活性的影響不顯著，高濃度的Cu2+脅迫顯著降低SOD活性，這與一些學者在水稻和空心連中關于Cu2+脅迫對SOD活性低促高抑的結論不一致[6，28]，這可能與植物生長環境、脅迫處理時間和研究作物品種有關。Cu2+脅迫處理下，2種抗氧化酶SOD和POD活性表現不一，原因是銅對抗氧化酶活性的影響可能同時表現為促進和抑制2個方面。一方面，過量Cu2+明顯提高POD在轉錄水平的表達，誘導同工酶的表達，以及對酶蛋白結構進行加工與修飾，提高POD的總活性[29];另一方面，Cu2+脅迫下產生的活性氧可以破壞SOD合成的DNA、RNA和蛋白質的結構，從而破壞SOD的表達系統和結構，降低酶的活性[30]。關于20～400 μg/g Cu2+脅迫是否促進POD同工酶表達破壞合成SOD的相關DNA、RNA和蛋白質結構是進一步研究的方向。

本研究以不同濃度（0、20、200、400 μg/g）Cu2+對大豆幼苗進行脅迫處理，研究外源Cu2+對大豆幼苗的毒害機理，分別測定脅迫處理后5、10、15 d大豆幼苗MDA含量、SOD活性、POD活性和根莖干鮮質量等指標，發現隨著Cu2+脅迫濃度的增加及脅迫時間的延長，MDA含量升高、SOD活性下降、POD活性升高、根莖干鮮質量減少。表明Cu2+脅迫抑制大豆幼苗的正常生長，MDA是表征Cu2+毒害的重要指標，為大豆幼苗的Cu2+毒害機理提供依據。

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