擬南芥細胞周期調控因子KRP2的原核表達及蛋白純化

楊旭穎 安麗君

摘要：表皮毛是由高等植物地上部組織表皮細胞發育而來的一種特殊結構，細胞周期調控因子在植物表皮毛細胞形態的建成過程中發揮著重要作用。利用原核表達系統，構建pET-28a-KRP2-FLAG融合表達載體，在大腸桿菌中對擬南芥細胞周期依賴激酶抑制因子KRP2進行了體外表達，并利用蛋白標簽FLAG和His對目的蛋白進行純化。結果表明，在大腸桿菌系統中成功對KRP2-FLAG進行了體外表達并得到了純化的蛋白，蛋白量為0.87 mg。這為進一步研究KRP2在表皮毛細胞發育過程中的作用奠定了基礎。

關鍵詞：表皮毛;細胞周期調控因子;KRP2;原核表達;FLAG標簽;His標簽;蛋白純化;擬南芥;基因克隆;重組蛋白

中圖分類號： Q78;S188+.2? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0063-03

植物表皮毛是植物地上組織表皮細胞形成的一種特化結構，與表皮鋪板細胞持續進行有絲分裂不同，表皮毛細胞在命運決定之后將退出有絲分裂周期轉而進入核內復制。在模式植物擬南芥中，成熟的葉片表皮毛細胞需要經歷4次核內復制，從而使其核內DNA含量達到32C，進而形成特定的形態[1]。細胞周期調控因子在細胞由有絲分裂向核內復制轉換的過程中發揮著關鍵的調節作用，其中細胞周期素依賴性激酶（CDK）是植物細胞周期的中心調控因子，細胞周期的一些進程是通過調節CDKs活性進行的[2]。與細胞周期素相對的是CDK抑制因子，它通過與CDKs直接結合負調控CDKs活性[3]。植物中第1種CDK抑制因子是由7種基因共同編碼的kip相關蛋白家族（KRP）：ICK1/KRP1、ICK2/KRP2、KRP3、KRP4、KRP5、KRP6、KRP7。ICK1/KRP1、ICK2/KRP2、KRP6過表達強烈抑制生長并且影響器官形態建成。KRPs是一類帶有C末端區域（CTD）的小蛋白，它是結合CDK或細胞周期蛋白并執行KRPs抑制功能所必需的一類因子[4]。而CDK活性在G1/M期和G2/M期轉換時會升高并且與蛋白磷酸化、起始DNA復制、有絲分裂相關;轉錄水平調控、蛋白互作、轉錄后修飾或蛋白降解都能改變CDK活性，最終調控細胞周期進程[5]。酵母雙雜體系中除了KRP5，其他KRPs都與CDKA;1（A類CDK激酶）互作而不與CDKB1;1互作，并且所有的KRPs可以與D型細胞周期素互作，表明KRPs抑制CYCD-CDKA復合物活性[6]。

CDKA;1和其特異性抑制因子KRP2調控擬南芥葉片發育過程中有絲分裂向核內復制的轉換。在有絲分裂活性組織中，調節KRP2過表達可降低CDKA;1活性，而在核內復制的組織中它的活性不會降低，反而促進核內復制。CDKA;1的弱表達導致了CDK有絲分裂活性的特異性抑制，從而誘導核內周期。CDKB1;1通過使KRP2磷酸化調控蛋白酶體降解;CDKB1;1的mRNA和蛋白水平在有絲分裂組織中要高于核內復制組織，表明CDKB1;1促進KRP2降解并且通過維持CDKA;1活性來抑制有絲分裂進入核內周期[7]。KRP2蛋白可以通過CDK磷酸化和蛋白酶體降解機制調節轉錄后翻譯[8]，不同CDK蛋白之間的互作可以控制不同時期特異的CDK活性。

為進一步研究KRP2在高等植物細胞周期中的生物學功能，本研究對擬南芥KRP2基因CDS序列進行克隆，并在其3′端添加編碼FLAG標簽的核苷酸序列，構建了pET-28a-KRP2-FLAG融合表達載體;通過在大腸桿菌BL21（DE3）中體外表達，利用鎳柱親和層析純化，成功獲得了His-KRP2-FLAG重組蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料、菌株和載體 擬南芥Columbia（Col-0）生態型野生型種子、大腸桿菌TOP10和BL21（DE3）、原核表達載體pET-28a，均由西北農林科技大學生命科學學院分子遺傳實驗室保存。

1.1.2 試劑 試驗中用到的限制性內切酶、高保真DNA聚合酶Prime Star、T4連接酶、牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）、反轉錄酶等購自Takara公司;His標簽蛋白純化柱填料Ni Sepharose 6 Fast Flow、硝酸纖維素膜（0.45 μm），購自通用電氣醫療集團生命科學部;6xHis抗體購自Abcam公司，FLAG抗體購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥KRP2基因片段克隆 提取野生型擬南芥總RNA，反轉錄獲得cDNA;以此為模板用帶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點的引物進行PCR擴增;引物序列F：5′-CATGGATCCATGGCGGCGGTTAGGAGAAG-3′;R：5′-CATCTCGAGTCACTTATCATCATCATCTTTATAATCTGGATTCAATTTAACCC-3′（下劃線分別表示BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點），引物由北京六合華大基因有限生物公司合成。用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切擴增片段和pET-28a載體，連接酶切產物并轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，對陽性重組質粒pET-28a-KRP2-FLAG進行測序鑒定[9]。

1.2.2 重組蛋白的誘導表達 將測序正確的重組質粒轉化至大腸桿菌BL21（DE3）表達菌株中，過夜培養后挑取陽性單克隆接種到50 mL LB液體培養基中，37 ℃、220 r/min小規模培養，待菌液D600 nm達到0.5～1.0時，加入終濃度為 0.2 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于 37 ℃ 誘導表達。分別收集誘導前和誘導后菌液，4 000 g離心10 min，收集菌體并用裂解緩沖液Lysis Buffer[50 mmol/L NaH2PO4（pH值8.0），300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑]重懸，冰浴，進行超聲破碎（25 W，工作5 s，間歇5 s，15 min），結束后4 ℃、1 000 g離心30 min，分別收集上清和沉淀。以誘導前菌液為對照，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳檢測重組蛋白的表達情況，之后利用BIO-RAD凝膠成像軟件分析誘導出的蛋白量，以不同梯度（0.125，0.250，0.500，1.000 mg/mL） 牛血清白蛋白BSA質量濃度為標準對照[10-11]。

由于重組蛋白N端帶有His，C端帶有FLAG標簽，所以本試驗同時用Anti-His和Anti-FLAG進行免疫印跡檢測。將2份蛋白樣品通過電轉儀轉移到硝酸纖維素膜上，室溫條件下用含50 g/L脫脂奶粉的TBST[20 mmol/L Tris-HCl（pH值7.5），體積分數0.1%的Tween 20，150 mmol/L NaCl]封閉 1 h，然后分別加入經封閉液稀釋的Anti-His（1 ∶ 10 000，體積比）和Anti-FLAG（1 ∶ 1 000，體積比）4 ℃過夜孵育，次日將2塊膜用1×TBST洗3次，然后均加入鼠抗G&M（1 ∶ 10 000 體積比）室溫孵育 1 h，1×TBST洗3次，再用TBS洗膜 5 min，加入ECL工作液進行顯色。

1.2.3 重組蛋白的純化 重組蛋白小規模原核表達成功后，按照原條件進行目標蛋白擴大培養，收集400 mL IPTG誘導后的菌液，4 ℃、10 000 g離心10 min，菌體用Lysis Buffer重懸，因為后續試驗需要有活性的蛋白，故超聲破碎后離心收集上清，并將上清用0.22 μm濾膜超濾，然后和600 μL鎳柱混合，室溫孵育1 h，轉入簡易重力柱裝置中，分別用0、50、100、200、400 mmol/L濃度的咪唑洗脫蛋白并檢測[12-13]。

2 結果與分析

2.1 擬南芥KRP2目的基因片段克隆

由擬南芥基因組數據庫（www.arabidopsis.org）公布的基因序列可知，KRP2基因的CDS長度為666 bp。以野生型擬南芥cDNA為模板，用帶有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點的引物擴增得到了與預期大小吻合的片段（圖1）;用BamHⅠ和XhoⅠ酶切目的片段與pET-28a載體（圖2），目的基因的條帶約為650 bp，載體骨架的大小約為5.3 ku。

2.2 原核表達載體pET-28a-KRP2的鑒定

目的基因片段與載體連接，連接產物轉化大腸桿菌后選取陽性克隆并提取質粒DNA進行雙酶切，經電泳檢測表明目的基因片段成功克隆到了pET-28a表達載體中（圖3）。為了驗證克隆到載體中的目的基因片段序列是否正確，將 pET-28a-KRP2重組質粒進行了測序，結果表明克隆到的序列與數據庫公布的序列完全一致，pET-28a-KRP2重組質粒構建成功，基因結構如圖4所示。

2.3 重組蛋白的誘導表達

將構建好的pET-28a-KRP2重組質粒轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，建立重組蛋白的原核表達系統。37 ℃、0.2 mmol/L IPTG誘導表達。取誘導前，誘導后及超聲波處理后的上清和沉淀檢測誘導表達情況。結果顯示，誘導后的菌液相比于誘導前在25～37 ku出現了新的蛋白條帶（圖5），與預測的KRP2蛋白分子量一致。為了進一步確認誘導表達出的蛋白條帶是目的KRP2-FLAG重組蛋白，分別以His和FLAG蛋白標簽的抗體對誘導出的蛋白進行免疫印跡檢測，結果表明誘導出的新蛋白條帶能被His標簽抗體和FLAG標簽抗體識別，證明本試驗利用原核表達系統成功誘導出KRP2-FLAG蛋白，且重組蛋白主要存在于沉淀，上清中量較少，表明得到的重組蛋白主要以包涵體形式存在。通過Image Lab軟件灰度分析對目的蛋白濃度進行定量，得到誘導后重組蛋白濃度約為0.181 mg/mL。

2.4 KRP2-FLAG重組蛋白的純化

試驗后續是研究KRP2與CDKA;1、CDKB1;1三者之間的互作效應， 需要具有活性的KRP2蛋白，而沉淀中的KRP2蛋白以不溶性包涵體形式存在，幾乎沒有活性，因而考慮通過擴大培養菌體，利用鎳柱親和層析純化上清中的活性重組蛋白。將誘導后的菌液經超聲波破碎后離心收集上清，與鎳柱室溫孵育后，用不同濃度咪唑洗脫并收集KRP2-FLAG蛋白，SDS-PAGE與免疫印跡檢測洗脫液。本試驗成功獲得了純度較高的重組蛋白，且利用BSA標準蛋白定量，最終共得到0.87 mg重組蛋白（圖6）。

3 討論與結論

植物中細胞分化調控已經取得了相當不錯的進展，然而對高度可信的植物發育調控還沒有一個較好的解釋。目前研究證明了一些通過轉錄因子直接控制細胞周期的相關基因，發現與細胞周期調控有關的因子主要包括三大類：細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，這3類因子相互作用，共同調控細胞周期[14]。KRP2作為CDK抑制因子之一，在G1/S轉換期，被泛素酶體降解掉，CDK被激活，進入S期。有絲分裂周期向核內周期的轉換機制對揭示細胞分化和器官大小控制進程具有重要作用，為進一步研究KRP2在高等植物中如何控制細胞進程，本研究通過克隆擬南芥KRP2基因，以及原核表達并純化出具有活性的重組KRP2-FLAG蛋白，以期為后續研究有絲分裂向核內周期轉換時CDKA;1、KRP2和CDKB1;1三者之間更為精確的互作效應奠定基礎。

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