井岡霉素、多菌靈和不動桿菌A2混用對水稻紋枯病病菌的抑制作用

朱彤彤 陳達川 袁夢思

摘要：為探索能夠高效防治水稻紋枯病的方法，以水稻紋枯病菌強致病菌株A111為供試菌株，通過室內平板試驗測定井岡霉素、多菌靈和不動桿菌A2混用對水稻紋枯病菌的抑制作用。結果表明，井岡霉素對水稻紋枯病菌的毒力較大，其EC50為0.026 4 mg/L;多菌靈的EC50為0.183 5 mg/L。研究發現，井岡霉素處理后的水稻紋枯病菌菌落呈不規則形態生長，菌絲和菌核的干質量隨藥劑濃度增加明顯下降;而多菌靈處理后的水稻紋枯病菌菌絲生長緩慢，菌絲和菌核的干質量降低程度低于井岡霉素。而井岡霉素、多菌靈與不動桿菌A2混用后對水稻紋枯病菌的抑制作用均高于單獨使用時的效果。由此可見，將井岡霉素和多菌靈與不動桿菌A2混用能夠更好地防治水稻紋枯病，為殺菌劑和生防菌的混用奠定了理論基礎。

關鍵詞：井岡霉素;多菌靈;不動桿菌;水稻紋枯病菌;生防菌混用

中圖分類號： S435.111.4+2? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0146-03

水稻紋枯病由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起，在南方稻區發生嚴重，是水稻上的主要病害之一，給水稻生產造成了巨大的經濟損失[1-3]。對于水稻紋枯病的防治，主要采用化學藥劑。其中，井岡霉素和多菌靈屬于高效低毒的廣譜內吸性殺菌劑，自20世紀70年代發現并使用以來，對水稻紋枯病的防治達到了顯著的效果。但由于藥劑的不合理使用及長期使用單一殺菌劑，造成菌株產生嚴重的抗藥性[4-6]。

生物防治是一種高效、安全的防治植物病害的方法，而且不污染環境，從而受到了人們的青睞，先后發現了芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）、放線菌（Actinomycetes）等常見的紋枯病拮抗菌[7-9]。但生防菌易受到不適宜土壤環境及其本身特性的影響，很難達到預期的防病效果。有研究證實，將殺菌劑和生防菌混合使用，可以有效延緩紋枯病菌的抗藥性，提高對水稻紋枯病的防治效果[10-11]。筆者在獲得1株高效拮抗水稻紋枯病菌的不動桿菌A2的基礎上[12]，仍以水稻紋枯病強致病菌株A111為供試菌株，在室內測定井岡霉素和多菌靈及其與不動桿菌A2混用后對紋枯病菌的抑制作用，旨在為深入探索殺菌劑和生防菌混用對水稻紋枯病的作用機制和提高防治效果提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 水稻紋枯病菌A111、不動桿菌A2均由長江大學微生物實驗室采集、分離和純化。

1.1.2 供試藥劑 5%井岡霉素A可濕性粉劑（武漢科諾生物科技有限公司）、25%多菌靈可濕性粉劑（山東省禾宜生物科技有限公司）。

1.1.3 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水補足至1 000 mL，pH值自然;馬鈴薯葡萄糖（PD）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水補足至1 000 mL，pH值自然;營養瓊脂（NA）培養基：牛肉膏 5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，水補足至 1 000 mL，pH值7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥劑毒力測定 將2種藥劑分別加入到融化好的PDA培養基中，使井岡霉素濃度為0、0.048、0.096、0.192、0.384、0.768 mg/L，多菌靈濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L。將培養48 h的水稻紋枯病菌菌塊（直徑7 mm）接種至含藥的PDA培養基中央，于28 ℃恒溫培養箱培養，48 h后依照十字交叉法測定各個處理的菌落直徑，以不含藥劑的培養基為對照，每個濃度重復3次。通過菌絲生長抑制率和各藥劑的有效濃度對數值之間的線性回歸分析，求出各藥劑的EC50值和EC90值。抑制率的計算公式如下：

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.2.2 菌落與菌絲形態觀察 將直徑7 mm的水稻紋枯病菌菌塊分別接種到上述藥劑濃度的PDA培養基中央，28 ℃培養。24 h后用插片培養法[13]添加蓋玻片，繼續培養72 h，蘇木精染色，采用倒置顯微鏡觀察，每個濃度重復3次。觀察并記錄不同濃度井岡霉素和多菌靈處理的菌落和菌絲的形態，并比較其差異。

1.2.3 菌核、菌絲干質量的測定 采用“1.2.2”節的方法，28 ℃ 培養15 d，收集菌核，烘干后稱其質量，每個濃度重復3次。

將2種藥劑分別加入裝有100 mL PD培養基的三角瓶中，使井岡霉素和多菌靈濃度如“1.2.1”節所述。每瓶接種10塊水稻紋枯病菌菌塊（直徑7 mm），每個濃度重復3次，以不加藥劑的培養基為對照，于28 ℃、120 r/min振蕩培養6 d，用布氏漏斗過濾收集菌絲體，烘干，稱質量。

1.2.4 井岡霉素、多菌靈和不動桿菌A2混用對水稻紋枯病菌的抑制作用 將不動桿菌A2在NA培養基上劃線后，挑取單菌落于5 mL NA液體培養基中，28 ℃、120 r/min過夜培養。分別配制含有不同濃度井岡霉素、多菌靈的PDA培養基，將直徑7 mm的水稻紋枯病菌菌塊接種至中央，在距離菌塊約2 cm處接種不動桿菌菌液，培養2 d后，以十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。以不動桿菌和紋枯病菌的混合接種及只接種紋枯病菌為對照，每個處理重復3次。

2 結果與分析

2.1 井岡霉素和多菌靈的毒力測定結果

由表1可見，井岡霉素對水稻紋枯病菌的毒力強于多菌靈，其EC50值為0.026 4 mg/L，而多菌靈的EC50值為 0.183 5 mg/L。測定2種藥劑的EC90結果表明，兩者的毒力相當，分別為0.440 8、0.459 0 mg/L，均可以用來防治水稻紋枯病。

2.2 井岡霉素和多菌靈對菌落形態的影響

由圖1中的A1至A6可以看出，在含有不同濃度井岡霉素的培養基上，水稻紋枯病菌生長緩慢，菌落邊緣凹凸不平，菌絲更為密集，且隨著濃度的增加菌落直徑明顯減小，甚至停止生長;而在對照培養基上，病菌生長良好，菌落形態規則。同樣，由B1至B6可知，多菌靈也能夠引起水稻紋枯病菌生長慢、菌落不規則和菌絲稀疏，但兩者對水稻紋枯病菌菌落形態的影響明顯不同。

2.2 井岡霉素和多菌靈對菌絲形態的影響

倒置顯微鏡觀察結果發現，井岡霉素和多菌靈處理后的水稻紋枯病菌菌絲分支增多、彎曲、畸形腫大、原生質滲漏、細胞核分布不均勻等，而未經處理的水稻紋枯病菌菌絲細長、原生質均勻、節間距大（圖2）。從菌絲形態來看，井岡霉素對水稻紋枯病菌菌絲的影響明顯強于多菌靈。

2.3 井岡霉素和多菌靈對菌核和菌絲干質量的影響

由表2可知，隨井岡霉素和多菌靈濃度增大，水稻紋枯病菌菌核和菌絲的干質量均明顯下降。更重要的是，隨藥劑濃度增大，在單位面積培養基上的菌核數量卻有所增加。研究還發現，井岡霉素在較低濃度時就可達到抑制菌核和菌絲生長的效果（數據略），這可能與井岡霉素抑菌效率較高有關系。

2.4 井岡霉素、多菌靈和不動桿菌A2混用對水稻紋枯病菌的抑制作用

由表3可知，不同濃度的井岡霉素和多菌靈與不動桿菌A2混合處理水稻紋枯病菌后，其抑制效果均高于井岡霉素、多菌靈和不動桿菌A2單獨處理。0.768 mg/L井岡霉素與不動桿菌A2混合處理抑菌率高達94.23%，而且井岡霉素與不動桿菌A2混用的抑菌效果略高于多菌靈與A2混用的效果。

3 結論與討論

目前，井岡霉素是防治水稻紋枯病高效、經濟、與環境相容性較好的抗生素農藥;多菌靈是苯并咪唑類殺菌劑，能夠與病原真菌的微管蛋白相結合，抑制細胞的有絲分裂，可以用來防治水稻紋枯病。但由于長期單一使用井岡霉素，導致水稻紋枯病菌產生了較強的抗性[14-15]。為此，研究不同濃度的井岡霉素和多菌靈對水稻紋枯病菌生長發育的影響具有重要意義。本研究結果顯示，井岡霉素和多菌靈均能抑制水稻紋枯病菌的生長，且井岡霉素防治效果要好一些，這與前人研究結果[16]基本一致。本試驗結果還表明，隨著井岡霉素和多菌靈濃度的增加，水稻紋枯病菌菌核和菌絲的干質量呈下降趨勢，但單位面積菌核數量有所增加，這與楊媚等的研究結果[17]有所不同，這可能與水稻紋枯病菌的菌核形成機制有關。

關于多菌靈的防病機制研究比較成熟，普遍認為能夠抑制病原菌的微管形成，從而導致病原菌不能增殖。而對于井岡霉素的防病機制則認為其不能殺死水稻紋枯病菌，但能抑制菌絲生長，導致菌絲畸形而影響其致病力，并可誘導水稻產生抗性防衛反應[18]。本試驗結果證明了井岡霉素和多菌靈均能引起水稻紋枯病菌菌絲的畸形和緩慢生長，從而防治病害的發生，但其對水稻植株防衛反應的影響等還需進一步研究。同時，為了減輕和避免水稻紋枯病菌抗藥性的產生，可以采取與生物防治相結合的方法。本研究結果表明，井岡霉素、多菌靈與不動桿菌A2混用后對水稻紋枯病菌的抑制作用均高于單獨使用時的效果，與張科等的研究結果[19-21]基本一致，為更高效地防治水稻紋枯病奠定了理論基礎。

總而言之，井岡霉素和多菌靈都可以用來單獨防治水稻紋枯病，且前者的防病效果更好一些。而井岡霉素、多菌靈與不動桿菌A2混用后對水稻紋枯病菌的抑制作用均高于單獨使用時的效果。筆者認為，對水稻紋枯病菌的綜合防治已經刻不容緩，今后需要加大對其抗藥性的動態監測、抑菌機制的探索以及多種殺菌劑混用的研究，進一步提高防治效果。

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