江蘇省主栽油菜品種根腫病抗性鑒定及分子標記檢測

彭琦 張椿雨 費維新

摘要：在安徽省休寧縣田間病圃內，利用根腫菌4號生理小種，對江蘇省主栽的30個油菜品種進行根腫病抗性鑒定。同時，利用已報道的與抗4號生理小種位點PbBa8.1緊密連鎖的分子標記A08-300對這30個品種進行分子檢測。結果顯示，30個品種的病情指數均在47及以上，都屬于感病或高感品種。此外，分子檢測結果表明，這30個品種中都不含有抗根腫菌4號生理小種的分子標記。目前江蘇省主栽油菜品種中沒有抗根腫病品種，各品種極易受到根腫菌的侵染，應引起生產者和育種者的高度重視。

關鍵詞：江蘇省;油菜;根腫病;抗性鑒定;分子標記

中圖分類號： S435.654? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0149-03

根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）侵染引起的一種重要土傳病害，它主要在十字花科植物間進行傳播。根腫病最早發現于地中海西岸和歐洲南部，現在全世界均有分布，尤以溫帶地區發生較嚴重[1]。根腫病的蔓延速度很快，在澳大利亞的每個州根腫病都已上升為嚴重的病害問題;在加拿大阿爾伯特省2003年僅僅發現 800 hm2 的油菜地感染根腫病，到2010年就有3.5萬hm2土地受到根腫病菌的侵染，其中嚴重發病地塊油菜產量損失達到30%以上，有的田塊甚至造成絕收[2]。由于該病原菌在土壤中可以存活10年以上，并借助農業機械跨區作業、風媒、水媒以及種子等途徑進行傳播。近年來，在我國長江流域冬油菜主要產區，油菜根腫病發生危害逐年加重，尤其是在我國四川、云南、湖北及安徽等地，油菜根腫病危害嚴重[3-4]，僅四川省發病面積就已超過20萬hm2。江蘇省局部地區已在油菜和其他十字花科蔬菜上發現根腫病，并存在擴展趨勢。江蘇省屬于長江下游油菜主產區，油菜的常年種植面積在30萬hm2以上，因此開展油菜品種抗根腫病的評價與鑒定對江蘇省油菜產業的發展具有重要的科學意義與應用價值。

本研究擬對江蘇地區主要栽種的30個油菜品種進行田間根腫病抗性鑒定，同時利用已報道的與抗4號生理小種位點PbBa8.1緊密連鎖的分子標記A08-300[5]對這30個品種進行分子檢測，以期了解江蘇省目前主栽油菜品種抗根腫病現狀，并為江蘇省抗病油菜品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

30個油菜品種均保存于江蘇省農業科學院種質資源圃，含江蘇品種16個、安徽品種2個、浙江品種2個、上海品種2個、湖北品種1個、上游區品種4個、黃淮區品種2個和加拿大品種1個;病圃鑒定感病對照中核雜488和抗病對照F4010-4由安徽省農業科學院費維新課題組提供;分子標記檢測抗病品種ZHE-226由華中農業大學張椿雨課題組提供。

1.2 油菜品種病圃（根腫菌4號小種）的鑒定

2015年，品種鑒定試驗安排在安徽休寧根腫病鑒定試驗病圃，病圃生理小種經Williams系統鑒定為4號小種。品種共30份，感病對照為中核雜488，抗病對照為F4010-4。1個品種種5行，1行20株苗，行寬2 m，3次重復，按照隨機區組排列。油菜出苗后1周可在水溝灌溉1次保持田間有充足的水分。油菜苗期保持病圃土壤的含水量充足，以保證油菜根腫病的發病穩定性。出苗90 d后，拔出植株，洗凈根部的泥土，調查記載油菜根腫病的發病情況。調查標準采用0～3級來分級，苗期油菜根腫病分級標準如下：0級為根部無病;1級為根部有細小腫瘤，體積少于根的1/3;2級為根部有中等腫瘤，體積是根的1/3～2/3;3級為根部有異常大腫瘤，體積超過根的2/3[6]。分別計算病株率及病情指數：

病株率=發病株數/調查總株數×100%;

病情指數=∑（病株數×相應病害級別）/（調查總株 數× 最高級別）×100;

校正系數K=50/對照品種的實際病情指數;

相對病情指數=K×鑒定材料的病情指數。

品種資源的抗病性差異根據相對病情指數進行分類：免疫（I）=0;0<高抗（HR）≤5;5<抗病（R）≤10;10<中抗（MR）≤20;20<中感（MS）≤30;30<感病（S）≤50;50<高感（HS）≤100[7]。

1.3 分子標記檢測

合成InDel（堿基缺失標記）A08-300標記引物[5]，引物序列如下：

正向引物（Rcr4F）：5′-GTAGTGCGGGCCACAAAAT-3′;

反向引物（Rcr4R）：5′-CACAATGGAGTGTTGAAATTCACT-3′。

利用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取30個主栽品種及華農抗病品種ZHE-226幼嫩葉片DNA，10 μL的PCR反應體系為0.5 μL DNA模板，正向/反向引物（10 μmol/L）各0.2 μL，0.5 μL dNTP（0.25 nmol/L），1 μL Taq酶，加H2O補齊到10 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35個循環;72 ℃延伸10 min，結束后10 ℃保存。PCR產物在6%變性聚丙烯酰胺中進行凝膠電泳，銀染顯影。

2 結果與分析

2.1 油菜品種病圃（根腫菌4號小種）的鑒定評價結果

2015年在安徽休寧病圃鑒定了江蘇主栽品種及資源材料30份，鑒定結果表明，這30份材料對安徽休寧的根腫病4號小種都不具有抗性。由表1可知，田間病圃鑒定根腫病病株率為57%～100%;病情指數為47～100。相對病情指數分析結果表明，30個品種中有13個品種對根腫菌4號小種感病（S），其他17個品種都達到了高感（HS）。

2.2 抗性標記檢測結果

聚丙烯酰胺凝膠電泳結果（圖1）表明，利用InDel標記A08-300引物進行分子標記檢測時，抗病對照目的片段序列比待檢測品種的目的片段都要小，也就是說待檢測的30個品種中都不含有抗根腫菌4號生理小種的分子標記。

2.3 抗性標記測序結果

為了更直觀看出分子標記的序列差異，筆者對抗病品種和感病品種的A08-300標記的測序結果進行比對分析（圖2）。結果發現，抗性標記序列全長132 bp，而在感病品種中的標記序列長度為139 bp。差異序列位于49 bp處，抗性標記缺失了7個堿基，即CTGTTGC。

3 討論與結論

根腫病是近年來從歐洲、澳洲、加拿大等地迅速蔓延至我國的一種非常嚴重的十字花科植物病害，已經嚴重影響到我國大部分地區油菜產業的發展。江蘇省地處長江下游，是我國油菜的重要產區之一。與之相鄰的安徽、浙江省均已有了對油菜根腫病的大量報道。因此，了解江蘇地區現有油菜品種的根腫病抗性將有助于應對根腫病的蔓延。

我國目前發現的油菜根腫菌生理小種類型主要有2、4、5、7、9、13號6種[1，8-9]。其中，以4號生理小種存在的范圍最廣，造成的危害最大。在Williams鑒定系統中，4個鑒別寄主對4號生理小種均表現為感病。因此，在本研究中主要利用4號小種來鑒定江蘇油菜主栽品種的根腫病抗性。遺憾的是，病圃鑒定結果表明，江蘇目前的栽培種都不具備對根腫菌4號生理小種的抗性，大部分品種甚至對根腫菌高感病，說明應當加快開展抗根腫病油菜品種選育。

目前，戰宗祥等通過種間雜交和分子標記輔助選擇，已經在國內率先育成一系列抗根腫病油菜新品系和品種，并已開發了相關分子標記[5]。為了將這些抗病材料用于江蘇等地區抗根腫病油菜品種改良，本研究首先對江蘇油菜品種進行分子標記檢測，結果發現江蘇品種不具備根腫病抗性的原因在于不含有相關抗性分子標記。通過雜交，可以使江蘇的品種帶上抗性標記，而通過分子標記輔助選擇則可以加快育種進程。為此，本研究對抗性標記進行測序和序列比對分析，并發現抗性標記序列缺少了7個堿基。研究結果將有助于開發新的標記用于油菜根腫病抗性品種選育。

參考文獻：

[1]費維新，Hwang S F，王淑芬，等. 根腫菌生理小種鑒定與甘藍型油菜品種資源的抗性評價[J]. 中國油料作物學，2016（5）：626-639.

[2]Strelkov S E，Hwang S F，Howard R J，et al. Progress towards the sustainable management of clubroot （Plasmodiophora brassicae） of canola on the Canadian prairies[J]. Prairie Soils Crops，2011（4）：114-121.

[3]馬淑青，黃 云，王錚一，等. 油菜根腫病菌形態及生物學特性研究[J]. 四川農業大學學報，2006，24（2）：161-165.

[4]Ren L，Jia J G，Li M，et al. Distribution of rapeseed clubroot disease in Hubei Province and evaluation of yield loss[J]. Agricultural Science & Technology，2012，13（4）：775-777.

[5]戰宗祥，江瑩芬，朱紫媛，等. 與位點PbBa8.1緊密連鎖分子標記的開發及甘藍型油菜根腫病抗性育種[J]. 中國油料作物學報，2015，37（6）：766-771.

[6]Rahman H，Shakir A，Jakir H M. Breeding for clubroot resistant spring canola （Brassica napus L.） for the Canadian prairies：can the European winter canola cv. Mendel be used as a source of resistance？[J]. Canadian Journal of Plant Science，2011，91（3）：447-458.

[7]四川省農業科學院植物保護研究所. 油菜根腫病抗性鑒定技術規程：DB51/T 1192—2011[S]. 成都：四川省質量技術監督局，2011.

[8]汪 春，李凱旋，彭衍彪，等. 安徽油菜根腫病菌生理小種鑒定及品種抗病性評價[J]. 安徽農業大學學報，2014，41（5）：772-776.

[9]季海雯，任 莉，陳坤榮，等. 油菜根腫病病原主要生理小種和品種抗性鑒定[J]. 中國油料作物學報，2013，35（3）：301-306.陳艷麗，姚愛梅，徐 義，等. 土壤化學性質和微生物群落結構與姜瘟發生相關性分析[J]. 江蘇農業科學，2019，47（12）：152-157.