植株成熟度與生長調節劑對黑喉石斛花芽誘導的影響

楊瀾 王愛華 石樂娟

摘要：黑喉石斛在自然條件下從播種到開花需要3年左右的時間。為了研究黑喉石斛的開花過程，縮短開花年限，采用組織培養方法研究不同因素對黑喉石斛試管內花芽誘導的影響。結果表明，（1）植株的成熟度與花芽誘導率相關性明顯;（2）植物生長調節劑TDZ+PP333組合可誘導黑喉石斛花芽形成，以0.2 mg/L TDZ+0.3 mg/L PP333組合誘導90 d苗齡的黑喉石斛幼苗試管開花率最高，為40.00%;（3）TDZ+PP333+NAA組合有利于叢生芽的增殖和試管內壯苗培養，以比例1 ∶ 5 ∶ 2和1 ∶ 8 ∶ 4的處理效果最佳。由此推測黑喉石斛試管內開花不僅跟植物生長調節劑的種類和濃度有關，還與植株的生理狀態相關。

關鍵詞：黑喉石斛;植物生長調節劑;組織培養;花芽誘導

中圖分類號： S682.310.4? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0190-03

黑喉石斛（Dendrobium ochreatum）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬多年生附生草本植物，也是珍貴的藥用石斛[1]。花期4～5月，花大且顏色艷麗，具有良好的觀賞價值。石斛幼年期較長，從營養生長到開花需要3年，受基因型及生長環境條件影響而有所差異。黑喉石斛的開花特性有別于其他同屬石斛，在成熟植株當年新生長出來的嫩莖上就能開花，無需等到第2年再開花，是研究石斛提早開花機制的理想材料。成花誘導是高等植物開花的基礎，決定著植物的開花時間。通過組織培養的方法可以實現植物在試管內完成成花誘導、花發育過程。該方法重復性強且不受季節和地域的限制，為研究植物開花的生理及分子生物學機制提供了一個理想的試驗系統。蘭花試管開花誘導條件具有很強的品種差異性[2]。植物開花是多種因素綜合作用的結果，眾多研究表明，植物生長調節劑[3-4]、氮磷鎂離子濃度和培養溫度[5]、植物材料成熟程度[6]等是影響石斛試管內開花的主要因素。植物材料成熟程度和植物激素對植物試管開花起著重要作用[6-7]。劉義存等研究指出，不同濃度的生長調節劑組合對試管中花芽形成的誘導效果有明顯的差別，其中細胞分裂素的作用最突出，而生長素次之[8]。目前利用組織培養技術已成功獲得了霍山石斛[9]、春石斛[10]、鐵皮石斛[11]試管開花苗。

通過組織培養的方式獲得黑喉石斛的試管開花材料是研究其開花生理及分子機制的有效方法，本試驗以單葉幼苗期（HH1）、原球莖晚期（HH2）、原球莖早期（HH3）黑喉石斛為研究材料，研究植物成熟度及植物生長調節劑[噻苯隆（thidiazuron，簡稱TDZ）、多效唑（paclobutraeol，簡稱PP333）]對其試管內花芽誘導的影響，以期探索出適宜的誘導時期和誘導培養基，為進一步建立試管苗誘導開花體系，研究其開花機制提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 不同成熟度無菌材料的培養

試驗時間為2016年5月，試驗在貴州省園藝研究所蘭花組培室進行。試驗材料采自于貴州省園藝研究所蘭花種質資源溫室，將采回的1個成熟未開裂的黑喉石斛蒴果用蘸有75%乙醇的棉球擦拭表面，再用0.1%氯化汞溶液浸泡 30 min，最后用無菌水浸泡沖洗5次，將蒴果表面的氯化汞溶液清洗干凈。之后在無菌器皿中將果莢從中間切開，將果莢內的種子播種于添加茶乙酸（NAA）的1/2MS（不含瓊脂和蔗糖）培養基中，果莢內剩余的種子放入無菌eppendroff管中保存備用，每間隔10 d播種1次，共播種3次。分別經過50、40、30 d培養，獲得3種成熟度的材料，分別為單葉幼苗期材料HH1、原球莖晚期材料HH2、原球莖早期材料HH3。

1.2 黑喉石斛試管內花芽誘導

以HH1、HH2、HH3黑喉石斛為試驗材料，采用不同濃度的TDZ+PP333組合進行黑喉石斛花芽誘導處理（表1），培養60 d后轉入1/2MS培養基中。所有培養基中附加香蕉 100 g/L、蘋果50 g/L、胡蘿卜50 g/L，將pH值調至5.4，培養條件：溫度為（23±2） ℃，光照度為1 000～1500 lx，光照時間為 11 h/d，且以不添加植物生長調節劑為對照（CK）培養基，培養90 d后觀察并統計試管內花芽數量及組培苗的生長情況，計算花芽誘導率，花芽誘導率=分化花芽的植株數/所有植株 數×100%。

1.3 黑喉石斛繼代培養1次后進行花芽誘導

將HH1、HH2、HH3的無菌苗轉入1/2MS繼代培養基中，培養60 d后再轉入B1～B10及無激素的對照（CK）培養基中（表2）。所有培養基中附加香蕉100 g/L、蘋果50 g/L、胡蘿卜50 g/L以及活性炭， 將pH值調至5.4。培養條件：溫度為（23±2） ℃，光照度為 1 000～1 500 lx，光照時間為11 h/d。培養90 d后統計試管內花芽數量及組培苗的生長情況，計算花芽誘導率。

2 結果與分析

2.1 黑喉石斛的無菌播種

為獲得不同生長時期的黑喉石斛無菌材料，本試驗分3個階段將黑喉石斛種子播種于1/2 MS+NAA萌發培養基上。通過觀察發現，經過30 d左右的培養，種子可萌發形成原球莖，萌發率超過99%;經過50 d的培養，可分化生長出莖和葉。

2.2 黑喉石斛試管內花芽誘導及生長情況

從表3可以看出，HH1、HH2、HH3黑喉石斛經過6種組合的TDZ+PP333誘導處理60 d后，處于單葉幼苗期的材料及經過A1（TDZ 0.05 mg/L+PP333 0.5 mg/L）、A2（TDZ 0.1 mg/L+PP333 0.5 mg/L）處理后轉入1/2 MS培養基生長90 d后出現花芽，花芽誘導率分別為5%、7%，其他處理及對照培養基中均未發現花芽。HH1、HH2、HH3經過處理后莖和葉營養器官的生長受到不同程度的抑制作用，表現為植株矮小，葉片小且數量少，莖長度縮短，生長遲緩。隨著TDZ與PP333濃度的不斷升高，對植株的營養生長抑制作用增強。當TDZ濃度達到0.2 mg/L時，葉片的分化受抑制，植株無法正常生長。PP333使HH1、HH2、HH3莖長度縮短，植株矮小。A1～A6 處理均在不同程度上影響黑喉石斛根、莖、葉的生長。無激素處理的對照植株相對于激素處理的植株生長速度更快，植株健壯。

2.3 繼代培養對黑喉石斛花芽誘導的影響

從表4可以看出，在B1～B10及對照培養基中，HH1、HH2、HH3的繼代苗在試管內生長情況不盡相同。低濃度的TDZ（0.1 mg/L）與PP333（0.3 mg/L）組合B1不僅無法誘導HH1、HH2、HH3的繼代苗花芽形成，而且叢生芽少，植株生長緩慢。B6（TDZ 0.2 mg/L+PP333 0.3 mg/L）、B8（TDZ 0.5 mg/L+PP333 0.5 mg/L）、B10（TDZ 0.2 mg/L）3種處理均能誘導HH1、HH2、HH3的繼代苗形成花芽。B6處理HH1繼代苗的花芽誘導率最高為40%，而B8、B10處理的花芽誘導率均低于10%（表5），且B8處理下容易出現畸形植株。其他的誘導培養基均無法誘導花芽生成，但對試管內壯苗、叢生芽增殖有一定的促進作用。B2、B3處理植株的叢生芽增殖率較高，可達到3～5倍;植株莖干增粗，葉片變寬，根部變粗且有根毛，生長健壯;適合3～4個月苗齡的黑喉石斛叢生芽誘導及壯苗培養。而B7、B8、B9處理中雖然也有叢生芽的增殖，但畸形苗較多，且部分葉片黃化，莖干基部出現不同程度的褐化。對照培養基中無花芽出現。

3 結論與討論

試管內的石斛苗要完成營養生長向生殖生長的轉變，除了要有適宜的培養基及培養條件之外，營養物質的有效積累也是決定其花芽分化是否成功的關鍵因素之一[12]。本試驗中3種成熟度黑喉石斛材料，單葉幼苗期材料HH1，經過A1（TDZ 0.05 mg/L+PP333 0.5 mg/L）、A2（TDZ 0.1 mg/L+PP333 0.5 mg/L）處理后轉入1/2 MS培養基生長90 d后出現花芽，花芽誘導率分別為5%、7%，后期植株莖伸長及葉片生長受到明顯抑制，可能是由于石斛材料成熟度較低的原因。原球莖材料HH2、HH3未誘導出花芽。經過60 d繼代培養的HH1、HH2、HH3材料均被B6處理誘導出花芽，誘導率分別為40.00%、21.32%、13.32%。B8、B10培養基誘導花芽率

植物生長調節劑的種類及濃度也是成功誘導石斛試管內開花的重要因素之一，尤其細胞分裂素的種類對于石斛花芽分化的作用極為顯著[13]。6-芐氨基嘌呤（6-BA）、2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-D）、噻苯隆（TDZ）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）等生長調節劑被研究者們廣泛應用于蘭花試管開花研究中，但不同蘭花適宜的生長調節劑種類跟用量存在較大差異。陳肖英發現，培養基中單獨添加低濃度的TDZ能成功誘導出霍山石斛花芽[14]。本試驗中單獨添加低濃度的TDZ（0.2 mg/L）可誘導3～4個月苗齡的黑喉石斛苗試管開花，但誘導率較低，試管內僅見少量花芽。TDZ與PP333能夠影響石斛的形態建成，促進其試管苗從營養生長階段轉變為生殖生長，在誘導蘭花植物春石斛、鐵皮石斛以及細莖石斛試管開花的研究中被證實有著重要作用[12，15-16]。李杰等發現，TDZ和PP333組合能誘導霍山石斛開花[9]。本試驗中低比例的TDZ和PP333組合A1（1 ∶ 10）、A2（1 ∶ 5）可誘導處理處于單葉幼苗期黑喉石斛試管開花。B6（TDZ ∶ PP333=2 ∶ 3）、B8（TDZ ∶ PP333=1 ∶ 1）培養基成功誘導3～4個月苗齡的黑喉石斛試管苗開花。隨著植株成熟度的增加，開花率逐漸增加，表現為HH1繼代苗（40.00%）>HH2繼代苗（21.32%）>HH3繼代苗（13.32%）。未添加植物生長調節劑的對照均不能誘導黑喉石斛形成花芽。TDZ+PP333+NAA組合雖未能誘導花芽出現，但對3～4個月苗齡的黑喉石斛試管苗叢生芽的增殖及壯苗培養有積極的促進作用，其中以比例1 ∶ 5 ∶ 2和 1 ∶ 8 ∶ 4 的處理效果最佳。

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