鹽度變化對單環刺螠非特異性免疫的影響

朱曉瑩 孟霄 甘宏濤

摘要：在溫度為15 ℃、pH值為8條件下，測定由初始鹽度2.5%變化至不同鹽度（1.5%、2.0%、3.0%、3.5%）對單環刺螠非特異性免疫指標（血細胞密度、SOD和ACP活力、MDA含量）的影響。試驗結果表明，鹽度變化后，血細胞密度在48 h內和鹽度呈顯著正相關;各試驗組SOD活力呈先升后降的趨勢，而MDA含量表現為先降后升，且MDA含量與SOD活力呈顯著負相關（r=-0.969，P<0.05）;ACP活力則呈現2種變化趨勢，鹽度1.5%和2.0%2組先降后升再降，鹽度3.0%和3.5%2組先升后降。至處理96 h，鹽度1.5%和3.5%2組的血細胞密度、SOD和ACP活力顯著低于對照組，而MDA含量顯著高于其他各組（P<0.05）。鹽度2.0%～3.0%為單環刺螠較適宜的環境條件，鹽度1.5%和3.5%條件下其免疫力顯著下降，以低鹽環境影響更為明顯。

關鍵詞：鹽度變化;單環刺螠;非特異性免疫;血細胞

中圖分類號： S917? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0197-03

單環刺螠（Urechis uniconcyus）主要分布于俄羅斯、日本、朝鮮以及我國黃渤海沿岸，是我國沿海存在的唯一無管螠目物種[1]。單環刺螠肉質鮮美、營養豐富，其必需氨基酸組成符合人體的吸收比例要求，并富含二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DPA）及Fe、Zn等微量元素，提取物中還有一定的抗腫瘤和提高免疫力作用，因此具有較高的經濟價值及良好的開發利用前景[2]。目前，對單環刺螠的研究主要集中于纖溶酶的分離純化和溶栓作用提取物的分析、硫化物的應激代謝以及人工繁育等方面[3-5]，而有關環境因子對單環刺螠免疫功能影響的報道相對較少。本研究觀察了不同鹽度條件下單環刺螠免疫相關指標的變化，旨在探討單環刺螠對鹽度的生理調節機制，為人工養殖水環境調控提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料

單環刺螠體長（15.1±1.5） cm、體質量（31.2±4.2） g，于2017年4月購自江蘇省連云港市水產品市場，采用循環養殖系統暫養7 d。暫養條件為：鹽度2.5%，pH值=8，水溫 15 ℃，自然光照，連續充氣，日投喂2次藻液。選擇大小相近、體表無損傷且活力強者用于試驗。

1.2 試驗設計

本試驗初始鹽度為2.5%，設對照組為2.5%，試驗組分別為1.5%、2.0%、3.0%、3.5%。并采用曝氣自來水和海水晶配制所需鹽度的人工海水，pH值為8。每組設3個平行，每個平行隨機放20條單環刺螠，于40 cm×30 cm×30 cm水族缸中飼養，水溫、餌料、充氣等養殖條件與暫養時相同。每天定時換水1次，每次換水50%。每個平行分別于6、12、24、48、72、96 h取3條單環刺螠，用蒸餾水沖洗，濾紙吸干體表水分，進行解剖并取其血液，保留部分全血用于測定血細胞密度，另一部分于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液血清，于-80 ℃保存，進行測定其他免疫相關指標。

1.3 檢測方法

用血球計數板計算血細胞密度，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力采用連苯三酚自氧化法測定[6]，酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）活力、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和樣品蛋白含量參考南京建成生物工程研究所試劑盒說明進行測定。

1.4 數據分析

試驗數據以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 18.0軟件進行單因子方差分析，LSD多重比較和Duncans檢驗，顯著水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 鹽度變化對單環刺螠血細胞密度的影響

由圖1可知，處理6 h時，各組血細胞密度和鹽度呈顯著正相關（r2=0.955，P<0.05），以鹽度1.5%組血細胞密度（1.20×108個/mL）最低，僅為鹽度3.5%組的67%。處理12 h時，各試驗組血細胞密度均有所上升，以鹽度3.0%、3.5%組升高幅度較大，并顯著高于鹽度2.5%組，而鹽度1.5%組血細胞密度雖有所回升，但仍顯著低于其他各組（P<0.05）。隨處理時間的延長，鹽度1.5%、3.0%、3.5%組血細胞密度呈現下降趨勢，至處理48 h時，各組血細胞密度和鹽度仍呈顯著正相關（r=0.987，P<0.05）。處理96 h后，以鹽度1.5%組血細胞密度最低，鹽度3.5%組次之，而鹽度2.0%、2.5%、3.0%組的血細胞密度組間差異不顯著（P>0.05）。

2.2 鹽度變化對單環刺螠SOD活力的影響

由圖2可知，鹽度變化對單環刺螠SOD活力的影響顯著。除鹽度2.5%組SOD活力略有波動外，其他組均呈先升后降趨勢。處理6 h，鹽度3.5%組SOD活力顯著高于其他組，處理 48 h 后升至最高值，隨后下降。鹽度1.5%和2.0% 2組SOD活力上升幅度較小，于處理24 h升至最高。鹽度3.0%組SOD活力在處理6 h時無明顯變化，隨著處理時間延長亦逐漸升高，至處理48 h升至最高，且上升幅度最大。處理96 h后，鹽度1.5%和3.5% 2組SOD活力顯著低于其他試驗組（P<0.05），較鹽度2.5%組分別下降54.53%和45.65%。

2.3 鹽度變化對單環刺螠MDA含量的影響

由圖3可知，鹽度變化后各試驗組MDA含量均呈先降后升的趨勢，以鹽度3.5%組MDA含量下降最為明顯。鹽度1.5%和3.5% 2組、鹽度2.0%和3.0%2組分別于處理24、48 h時降至最低，隨后逐漸上升。至處理96 h，以鹽度1.5%組MDA含量最高，鹽度3.5%組次之，其他3個試驗組間相近（P>0.05），且MDA含量與SOD活力呈顯著負相關（r=-0.969，P<0.05）。

2.4 鹽度變化對單環刺螠ACP活力的影響

由圖4可知，鹽度變化后，單環刺螠ACP活力呈現2種變化趨勢，由初始鹽度2.5%下降至1.5%和2.0%，ACP活力呈現先降后升再降的趨勢;而由鹽度2.5%升高至3.0%和3.5%，ACP活力則呈現先升后降趨勢。鹽度1.5%和2.0%2組在處理6 h后，ACP活力顯著低于對照組，隨后回升，至處理24 h后升至最高值后下降。鹽度3.0%組和3.5%組ACP活力分別處理72、48 h后升至最高，以鹽度3.0%組上升幅度最大。處理96 h后，以鹽度3.0%組ACP活力最高，鹽度1.5%和3.5%2組顯著低于對照組（P<0.05）。

3 討論

3.1 鹽度變化對單環刺螠血細胞密度的影響

無脊椎動物血細胞是其免疫功能的主要實施者，血細胞在發揮吞噬功能時還會釋放一些免疫因子，與血淋巴中的其他免疫因子互相協同以抵御外來病原對機體的侵害[7]。據報道，鹽度變化對血細胞有顯著影響，降低和升高都會導致血細胞減少，而低鹽度條件下血細胞減少更為顯著[8-9]。但

Reid等研究發現，鹽度在2.0%～4.0%范圍內，菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）血細胞密度在鹽度為2.0%時減少，在鹽度為4.0%時顯著增多[10]。本結果表明，鹽度變化對單環刺螠血細胞密度有顯著影響，短期內高鹽度3.5%組單環刺螠血細胞密度顯著增多，這與Reid等的高鹽度脅迫下血細胞密度顯著增多的研究結果[10]一致。隨著處理時間的延長，鹽度2.0%、2.5%和3.0%組的血細胞密度無顯著差異，但鹽度1.5%和3.5%2組血細胞密度顯著低于其他試驗組，與Zhao等對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的研究結果[11]相近。在處理6～48 h，單環刺螠的血細胞密度和鹽度呈顯著正相關，這可能由于鹽度變化后，機體處于低滲或高滲環境中，為調整體內外滲透壓的平衡而導致血細胞密度變化。長時間脅迫下，鹽度15和35兩組血細胞密度顯著降低，表明單環刺螠處于不適宜鹽度環境下其免疫力受到較大的影響。

3.2 鹽度變化對單環刺螠SOD活力和MDA含量的影響

生物體在新陳代謝過程中會產生活性氧自由基，對機體可造成氧化損傷，而SOD可以清除過量的自由基，對保護機體免受自由基損害起著重要作用[12]。Wang等將鹽度由2.5%變化至0.5%、1.5%和3.5%后96 h，凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）血液SOD活力分別下降52%、27%和24%[13]。鄭慧等研究發現，鹽度變化會引起刺參（Apostichopus japonicus）體腔液SOD活力降低[14]。本研究結果表明，鹽度的升高或降低都會使單環刺螠SOD活力呈先升后降的趨勢，表明機體在遭遇鹽度突變時，會引發一系列生理應激反應，產生過量的氧自由基，誘發SOD活性增強，以降低鹽度突變對機體的氧化損傷，增強免疫能力和對鹽度突變的耐受能力，與高杉等對大竹蟶（Solen grandis）的研究結果[15]一致。鹽度變化96 h后，鹽度變化幅度較大的15和35兩組SOD活力顯著下降，表明機體的滲透調節負擔過重會導致其抗氧化系統受損，尤以低鹽的影響更為顯著。

MDA是生物膜中多不飽和脂肪酸在活性氧自由基攻擊下而引發脂質過氧化的產物，其含量能夠直接反應體內脂質過氧化的強度和速率，可廣泛用于氧化應激中自由基產生和生物膜氧化損傷程度的評價指標[16]。季延濱等將革胡子鲇（Claries lazera）的水體鹽度升高96 h后，其血清MDA含量顯著升高[17]。鹽度變化后單環刺螠MDA含量均呈先降后升的趨勢，以鹽度1.5%和3.5%2組變化幅度較大，表明低鹽度短時間的鹽脅迫能引起機體應激反應，適當提高其免疫力，而長時間高鹽度變化會造成較大的氧化損傷。本研究中MDA含量與SOD活力呈顯著負相關，故可將SOD活力和MDA含量的長期變化用于評價鹽度變化下單環刺螠的免疫狀態。

3.3 鹽度變化對單環刺螠ACP活力的影響

ACP是在酸性條件下，催化磷酸單酯水解的酶為溶酶體的標志酶，在溶酶體發揮正常生理功能及機體免疫中起重要作用[18]。印度明對蝦（Fenneropenaeus indicus）在鹽度變化后其ACP活力均呈先升后降的趨勢，于72 h升至最高[19]。在鹽度2.5%、3.5%、4.0%下，刺參體腔液ACP活力于10 d達到最高值后下降[14]。本研究中，由鹽度2.5%升高至3.0%、3.5%，單環刺螠ACP活力先升后降，與上述研究結果相近。鹽度3.0%組ACP活力升高幅度最大，且處理96 h后仍然顯著高于鹽度2.5%組，表明適當的鹽度變化可刺激機體的免疫力有所提高。而由初始鹽度2.5%下降至1.5%和2.0%，單環刺螠ACP活力表現為先下降，表明機體處在低鹽環境下，進行滲透壓調節需要消耗更多能量從而影響其免疫力。鹽度變化96 h后，鹽度2.0%組ACP活力與鹽度2.5%組相近，表明適當的鹽度下降后，機體通過一段時間調整可達到新的滲透平衡;而鹽度1.5%和3.5%2組ACP活力顯著低于對照組，表明過低和過高的鹽度都會對機體免疫力產生不利影響。

綜上所述，鹽度變化對單環刺螠非特異性免疫有較大影響，鹽度2.0%～3.0%為單環刺螠較適宜的環境條件，鹽度1.5%和3.5%條件下其免疫力顯著下降，以低鹽環境下影響更為明顯。在適當范圍內，機體可通過自身的調節來適應環境中的鹽度變化，但鹽度的變化幅度較大會使機體的生理機能遭受脅迫，免疫力下降，可能引起疾病暴發。因此，在單環刺螠的養殖過程中，養殖水環境的鹽度變化不容忽視，尤其是連續降雨造成養殖水體的鹽度急劇下降時要注意及時換水。

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