江蘇地區1株錦鯉皰疹病毒的鑒定

袁銳 方蘋 倪金俤

摘要：對我國江蘇地區養殖錦鯉暴發性鯉皰疹病毒病（koiherpes virus disease，簡稱KHVD）的病原進行鑒定。2018年5月，江蘇省一錦鯉養殖場暴發不明原因傳染疾病，病魚肝、脾、腎臟中未分離到細菌。透射電鏡觀察發現大量球狀病毒粒子。提取自然發病魚的鰓、腎、脾、肝組織DNA作為模板進行PCR檢測，結果顯示為陽性。Blast比對結果顯示，擴增序列與錦鯉瘡疹病毒（koi herpesvirus，簡稱KHV）胸苷激酶（thymidine kinase，簡稱TK）基因和KHV DNA聚合酶（SPH）基因核苷酸序列同源性為99%。對病毒株的TK基因全長序列進行系統發育分析，證實該毒株屬于KHV亞洲型毒株。

關鍵詞：錦鯉;錦鯉皰疹病毒;病毒鑒定;系統進化分析

中圖分類號：S941.41+2?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0200-04

鯉皰疹病毒病（koiherpes virus disease，簡稱KHVD）是由錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，簡稱KHV）引起錦鯉和鯉魚及其普通變種的一種急性、接觸性傳染病，該病被我國農業部列為二類動物疫病，對鯉魚和錦鯉的養殖危害極大，致死率高達80%～100%[1～3]。其病原KHV是雙鏈DNA病毒，基因組全長為295 kb[4]，編碼164個開放閱讀框，KHV有多種基因型，目前已完成全基因組測序的分離株有日本株（KHV-J）、美國株（KHV-U）、以色列株（KHV-I）以及在我國分離的KHV-GZ11，其中，KHV-U、KHV-I和KHV-GZ11的相似性較高[4-5]。目前，我國國內報道并成功分離的KHV毒株有遼寧株（KHV-cj）、廣州株（KHV-GZ1301）、黑龍江株（KHV-hlj）等[6-8]。現有研究表明，KHV是一種具有高傳染性、高發病率和高死亡率的病毒性疾病，可感染任何年齡的錦鯉與鯉魚，其典型臨床癥狀是行動遲緩、食欲不振、體表尤其是皮膚和鰭基部出現出血癥狀，嚴重者眼球凹陷、鰓蒼白并伴有中度至嚴重的壞死，感染后7～10 d開始出現死亡[9-11]。由于KHVD流行范圍廣，危害大，已經引起我國及世界多個國家的高度重視[12]。

2018年5月，江蘇省蘇州地區一錦鯉養殖場發生大面積死亡，發病魚體表黏液明顯增多，眼球凹陷，全身體表多處出血，尤其是鰭基部嚴重出血，剖檢后可見病魚脾臟、腎臟明顯腫大，然而從內臟器官中未能分離檢測到細菌，鏡檢也未見寄生蟲。根據病魚的臨床特征及發病時間初步判斷該病由KHV引起，為進一步驗證導致錦鯉大量死亡的原因，根據我國水產行業標準SC/T 7212.1—2011《鯉皰疹病毒檢測方法第1部分：錦鯉皰疹病毒》設計檢測引物進行病毒PCR檢測，對病灶部位的電鏡觀察顯示。根據胸苷激酶（thymidine kinase，簡稱TK）基因全長序列建立系統發育樹，研究其株型。本研究首次報道KHV在我國華東地區暴發流行。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集

患病魚于2018年5月采自江蘇省某觀賞魚養殖場，體長50 cm左右，充氧打包運輸至實驗室。

1.2 主要試劑

病毒DNA提取試劑盒、腦心浸液培養基（BHI）購自北京陸橋生物技術有限公司;PCR Mix預混液購自TaKaRa公司;戊二醛等試劑均為國產分析純。

1.3 細菌學檢查

對病魚進行解剖觀察，同時在無菌操作條件下，從肝臟、脾臟、腎臟取樣進行BHI平板、血平板劃線分離細菌，28 ℃培養24～48 h，觀察病菌生長狀況，待菌落形成后進行菌落純化和鑒定。

1.4 電鏡觀察

以去離子水配制2.5%的戊二醛固定液，取鰓、腎、肝、脾組織切成薄片，浸泡于戊二醛固定液中固定，在用透射電鏡觀察前，將組織取出切成0.5 cm×0.5 cm大小的小塊，用透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.5 PCR鑒定

病魚的組織DNA提取按照病毒DNA提取試劑盒的說明進行操作。PCR檢測所用引物及檢測方法參照我國水產行業標準SC/T 7212.1—2011《鯉皰疹病毒檢測方法第1部分：錦鯉皰疹病毒》進行。引物由TaKaRa公司合成，引物序列見表1，TK基因的擴增體系為 50 μL，反應體系包括25 μL Mix預混液，2.5 μL DNA模板，引物各0.5 μL（濃度為 100 μmol/L），21.5 μL ddH2O，擴增條件：94 ℃預變性5 min;95 ℃變性1 min，51 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，40個循環;72 ℃ 10 min，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，預期得到約409 bp的PCR產物。SPH基因的擴增體系為100 μL，反應體系包括50 μL Mix預混液，5 μL DNA模板，引物各1 μL（濃度為 100 μmol/L），43 μL ddH2O，擴增條件：94 ℃ 預變性30 s;94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環;72 ℃ 10 min，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，預期得到約292 bp的PCR產物。將PCR產物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測得的序列登錄美國國家生物技術信息中心（NCBI）進行BLAST比對。

1.6 系統發育分析

2 結果與分析

2.1 解剖及病原檢查

患病錦鯉體長約50 cm，魚體明顯缺乏活力，食欲減退，體表黏液增多，鰓絲發白（圖1），病魚鰭基部及體表出血嚴重（圖2），解剖后發現脾臟等內臟腫大，其臨床癥狀類似于KHV感染。制作鰓絲水浸片進行寄生蟲的顯微鏡檢查，未觀察到寄生蟲。

2.2 病原菌的分離

從病魚的肝、脾、腎組織中未能分離到病原菌。

2.3 電鏡觀察

取病魚的鰓、腎、脾、肝組織進行透射電鏡觀察，結果表明，在腎臟和脾臟組織中，可明顯地觀察到大量成熟或不成熟病毒粒子（圖3、圖4），形狀為圓形，有囊膜結構，其直徑在200 nm左右，呈現出典型的皰疹病毒特征，由此證實該病毒對于魚體的感染。

2.4 PCR鑒定

根據我國水產行業標準（SC/T 7212.1—2011）提供的PCR檢測方法對發病魚的鰓、腎、肝、脾進行KHV的TK和SPH基因特異性PCR擴增，均檢測到預期大小的片段（圖5），對PCR產物進行測序，經NCBI比對，序列與KHV的TK和SPH基因序列具有99%的同源性，將該毒株命名為KHV-JS。

2.5 系統發育分析

對KHV-JS樣進行TK全長序列擴增，將1 000 bp左右的目的片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行克隆測序。結果顯示，分離株的TK基因全長為997 bp，將測得序列與GenBank中登錄的KHV序列進行比較，其與KHV-A1的同源性為100%。依據鄰接法利用MEGA 7.0建立系統發育樹，從圖6可以看出，本試驗中鑒定的KHV-JS株與各個亞洲株型聚在了一起，為典型KHV亞洲株型。

3 討論

錦鯉皰疹病毒病是一種具有高傳染性、高發病率和高死亡率的病毒性疾病，給我國及世界多個國家的錦鯉及鯉魚養殖業造成嚴重的經濟損失，被世界動物衛生組織水生動物疫病名錄收錄[15]。KHVD一般發病于春秋季節，高溫夏季、低溫冬季不發病，發病溫度為18～28 ℃[16]，主要感染各個生長階段的錦鯉和鯉魚，相關研究表明，金魚[12]、異育銀鯽[17]等魚類也有可能感染KHV，并可能作為病毒攜帶者，但是到目前為止還沒有除錦鯉和鯉魚以外的其他魚類感染KHV導致發病的報道。鯉魚是我國的主要淡水養殖魚類之一，錦鯉則是我國最主要的觀賞魚養殖品種之一，一旦暴發錦鯉皰疹病毒病，高達100%的死亡率將給我國水產養殖和觀賞魚產業帶來巨大的經濟損失，因此，亟須開展對該病的流行病學調查和防控研究。

目前，我國已有多地流行和暴發過KHVD，主要集中在廣東、東北和四川等地區，國內報道并成功分離的KHV毒株有廣州株（KHV-GZ11和KHV-GZ1301）、遼寧株（KHV-cj）、黑龍江株（KHV-hlj），其中，除廣州株KHV-GZ11屬于歐洲株型外，其他毒株均屬于亞洲株型。本研究首次報道KHVD在我國華東地區的暴發，并且成功分離鑒定了KHV-JS株。江蘇省是我國淡水魚養殖大省，全省水產養殖面積達到

63.21 hm2，其中淡水養殖總面積為43.98 hm2，水產品總產量達328.1萬t，主要養殖青魚（Mylopharyngodon piceus）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）、鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙魚（Aristichthys nobilis）、鯉魚（Cyprinus carpio）、鯽魚（Carassius auratus）等，觀賞魚養殖規模達到86 234萬尾，占全國總規模的20.73%，錦鯉作為一種重要的觀賞魚類，深受消費者喜愛，具有廣闊的市場前景，然而鯉皰疹病毒病的高死亡率以及具有潛伏感染的特性[18]，嚴重威脅著錦鯉和鯉魚養殖業的安全。

疫苗是控制病毒性疾病最有效的途徑，在一些常見的水產動物病毒病上應用廣泛。減毒疫苗以及改良的活疫苗都被證明具有顯著的抗病效果，但是其潛在的安全隱患仍然令人擔憂，一系列不安全因素阻礙了其在生產上的應用[19]。相比傳統疫苗，DNA疫苗更安全，沒有毒力返強的風險，是病毒疫苗未來的發展趨勢，由于不同地區KHV毒株基因型具有一定的差異性，因此對不同來源毒株進行系統發育分析以及株型鑒定，對于DNA疫苗的研制具有重要意義。Kurita等證明，來自亞洲和歐洲的隔離群有著明顯的基因差異，可通過對TK基因全長序列的測定將KHV毒株區分為歐洲型和亞洲型[13]。本研究獲得KHV-JS的TK基因全長序列為997 bp，經MEGA 7.0構建系統發育樹，表明KHV-JS屬于亞洲株型。本研究首次從我國華東地區分離鑒定1株KHV，可為KHV起源進化、分類以及疾病診斷和防控提供重要依據。

參考文獻：

[1]Boutier M，Ronsmans M，Rakus K，et al. Cyprinid herpesvirus 3：an archetype of fish alloherpesviruses[J]. Advances in Virus Research，2015，93：161-256.

[2]Brogden G，Adamek M，Proepsting M J，et al. Cholesterol-rich lipid rafts play an important role in the Cyprinid herpesvirus 3 replication cycle[J]. Veterinary Microbiology，2015，179（3/4）：204-212.

[3]Boutier M，Ronsmans M，Ouyang P，et al. Rational development of an attenuated recombinant Cyprinid herpesvirus 3 vaccine using prokaryotic mutagenesis and in vivo bioluminescent imaging[J]. PLoS pathogens，2015，11（2）：e1004690.

[4]Aoki T，Hirono I，Kurokawa K，et al. Genome sequences of three koi herpesvirus isolates representing the expanding distribution of an emerging disease threatening koi and common carp worldwide[J]. Journal of Virology，2007，81（10）：5058-5065.

[5]Li W，Lee X，Weng S P，et al. Whole-genome sequence of a novel Chinese Cyprinid herpesvirus 3 isolate reveals the existence of a distinct European genotype in East Asia[J]. Veterinary Microbiology，2015，175（2/3/4）：185-194.

[6]李瑩瑩，王 慶，曾偉偉，等. 錦鯉皰疹病毒GZ1301株的分離與鑒定[J]. 水產學報，2014，38（8）：1159-1166.

[7]朱 霞，李新偉，王 好，等. 一株錦鯉皰疹病毒的分離與鑒定[J]. 中國預防獸醫學報，2011，33（5）：340-343.

[8]薛淑群. 錦鯉皰疹病毒（KHV-hIj）株的分離與表達載體構建[D]. 哈爾濱：東北林業大學，2012.

[9]Ilouze M，Dishon A，Kotler M. Characterization of a novel virus causing a lethal disease in carp and koi[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2006，70（1）：147-156.

[10]Jha P，Barat S. The effect of stocking density on growth，survival rate，and number of marketable fish produced of koi carps，Cyprinus carpio var. koi in concrete tanks[J]. Journal of Applied Aquaculture，2005，17（3）：89-102.

[11]Jha P，Barat S. Effect of water exchange on water quality and the production of ornamental carp（Cyprinus carpio var. koi L.）cultured in concrete tanks manured with poultry excreta[J]. Archives of Polish Fisheries，2005，13（1）：77-90.

[12]El M M，Saleh M，Soliman H. Detection of Cyprinid herpesvirus type 3 in goldfish cohabiting with CyHV-3-infected koi carp（Cyprinus carpio koi）[J]. The Veterinary Record，2007，161（23）：792-793.

[13]Kurita J，Yuasa K，Ito T，et al. Molecular epidemiology of koi herpesvirus[J]. Fish Pathology，2009，44（2）：59-66.

[14]陳俊杰，李媛瑗，陽瑞雪，等. 四川地區一株錦鯉皰疹病毒的分離鑒定及系統進化分析[J]. 水產學報，2018，42（1）：1-8.

[15]Antychowicz J. Notifiable diseases in OIE manuals and European union legislations[J]. Medycyna Weterynaryjna，2006，62（9）：977-980.

[16]Hedrick R P，Gilad O，Yun S，et al. A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi，a strain of common carp[J]. Journal of Aquatic Animal Health，2000，12（1）：44-57.

[17]Potkonjak A，Nikolin V. Common fish species in polyculture with carp as Cyprinid herpesvirus 3 carriers[J]. Acta Veterinaria，2012，62（5/6）：675-681.

[18]Reed A N，Izume S，Dolan B P，et al. Identification of B cells as a major site for Cyprinid herpesvirus 3 latency[J]. Journal of Virology，2014，88（16）：9297-9309.

[19]鄭樹城，王 慶，李瑩瑩，等. 鯉皰疹病毒3型研究進展[J]. 病毒學報，2016，32（1）：108-120.李 柯，王志剛，毛麗盈，等. 中華沙鰍的兩性異形和雌性繁殖能力[J]. 江蘇農業科學，2019，47（12）：204-208.