納米金比色法在家蠶微孢子蟲檢測中的應用

戴衛江 陳紅麗 張志林

摘要：家蠶微粒子病被列為蠶種生產的唯一檢疫對象，母蛾鏡檢家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis，簡稱Nb）是目前最主要的檢疫手段，但其準確性受到多種因素影響。建立一種簡便、快捷、準確的Nb檢測技術，對家蠶微粒子病的防治具有重要意義。基于納米金（AuNPs）比色法原理，對AuNPs探針的制備及其標記的最佳抗體濃度和最佳pH值進行探究，以及探究AuNPs比色法檢測Nb的靈敏度。結果表明，Nb抗體與AuNPs（20 nm）結合最佳濃度為每500 μL AuNPs溶液中添加5 μL 0.5 mg/mL抗體蛋白，標記最佳pH值為8.5。AuNPs比色法能夠最低檢測出Nb蛋白量為 10 ng。本研究成功建立一種基于AuNPs比色法檢測Nb的新方法。

關鍵詞：家蠶微孢子蟲;多克隆抗體;納米金;探針;比色法

中圖分類號：S884.2+1?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0208-04

家蠶微粒子病經常給蠶業生產帶來巨大的經濟損失，嚴重影響蠶絲產業的穩定，由于家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis，Nb）能經胚種傳染，因此，Nb被列為蠶種生產的唯一法定檢疫對象[1-3]。目前最主要的檢疫手段母蛾鏡檢法主要依賴檢驗人員的判斷，主觀性強，其準確性受到多種因素的影響[2-4]。免疫學和分子生物學等檢測技術在微孢子蟲檢測鑒定方面已有PCR技術[5]、酶聯免疫吸附法[6]、膠體金免疫層析技術[7]、熒光抗體技術[8]、單抗體金銀染色法[9]、酶標抗體檢測法[10]、核酸分子雜交技術[11]等，這些檢測技術對儀器設備和檢測人員的技術水平有嚴格要求，檢測成本高且不易操作。因此，建立一種簡便、快捷、準確的Nb檢測技術，對家蠶微粒子病的防治具有重要意義。

納米金（AuNPs）比色法主要是利用AuNPs表面等離子體共振引起的顏色和吸光度發生變化，對目標物質進行檢測的方法[12-13]。在溶液中，單分散的AuNPs（20 nm）呈現酒紅色，并且具有相對較窄的表面等離子體吸收帶，在紫外-可見光吸收光譜（UV-vis）光譜中最大吸收峰波長為523 nm[14]。相反，含有AuNPs聚集體的溶液則呈現紫色或者藍色，這是由于AuNPs表面的等離子體共振吸收峰發生紅移[12]。將蛋白質等物質作為形成AuNPs聚集體的連接點，導致檢測體系顏色改變，從而達到了對目標物質有效檢測[15-19]。Lee等發明了一種基于AuNPs比色檢測Hg2+的方法，該方法的檢測下限達到 100 nmol/L[20]。Cordray等發明了一種檢測目標寡核苷酸濃度的AuNPs比色法，該方法在200 μL試驗體積內可以定量檢測出 50 amol～500 fmol 目標寡核苷酸[13]。Li等發明一種檢測牛奶中β-酪蛋白的AuNPs比色法。該方法將抗體結合在AuNPs上，根據抗原抗體特異性結合，使分散的AuNPs聚集，膠體顏色由酒紅色逐漸變成無色，檢測限可低至 0.03 μg/mL[21]。由于AuNPs比色法具有簡單、快速、成本低、肉眼可見等優點[23-26]，因此本研究以Nb總蛋白為抗原制備多克隆抗體，從而制備抗體探針，以此來探究AuNPs比色法在Nb檢測中應用的可行性，期望為AuNPs比色法今后在Nb檢測上的應用打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2017年8月至2018年3月在中國農業科學院蠶業研究所病理研究室完成。

1.1 材料與主要試劑

1.1.1 病原來源 Nb由中國農業科學院蠶業研究所家蠶生理與病理研究室保存，系利用純化的家蠶微孢子懸液（濃度108個/mL）給家蠶品種菁松×皓月4齡起蠶添食感染后，從患病家蠶中分離提取獲得。

1.1.2 主要儀器與試劑 玻璃珠（sigma-aldrich）購自于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，研磨器購自于美國Biospec公司，透射電子顯微鏡購自于荷蘭Philips公司，Onedrop OD-1000紫外分光光度計購自于上海吉盛醫學科技有限公司，檸檬酸三鈉購自西隴化工股份有限公司，氯金酸購自國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 納米金（AuNPs）制備 對100 mL質量分數為0.01%的氯金酸溶液進行加熱和攪拌（轉速500 r/min），煮沸后，快速加入1.8 mL質量分數為1%的檸檬酸三鈉溶液，持續煮沸，在溶液顏色穩定為酒紅色后繼續加熱5 min，停止加熱并持續攪拌30 min[27]。即合成了檸檬酸三鈉包裹的納米金溶膠，自然冷卻至室溫后，定容至100 mL，4 ℃保存備用。用透射電鏡拍攝和紫外-可見光譜掃描對所制備的納米金進行表征。

1.2.2 家蠶微孢子蟲總蛋白提取及其抗體制備 在珠磨式研磨器專用管中加入經percoll純化的1 mL Nb（109個/mL）。之后加入酸洗玻璃珠，并以轉速為4 800 r/min進行破碎，每次1 min，破碎6次。之后，破碎液中加入0.3 mL樣品裂解液（0.125 mol/l Tris-HCl、5% SDS、50%甘油、5% β-巰基乙醇），充分混勻，4 ℃孵育12 h，8 000 r/min離心10 min，之后將上清液進行超濾，將Nb總蛋白置換到PBS中，超濾條件為4 ℃、4 000 r/min離心30 min，重復操作將樣品濃度調至 1 mg/mL。將所獲得Nb總蛋白作為抗原進行抗體制備[德泰生物科技（南京）有限公司制備]。

1.2.3 抗體與AuNPs結合的最佳pH值 確定配置500 μL不同pH值（5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10）的納米金溶液，之后分別加入10 μL 0.5 mg/mL Nb多抗溶液，振蕩 20 min 后室溫放置10 min;然后分別加入50 μL的10% NaCl溶液，振蕩混合10 min，室溫下放置2 h，于波長520 nm測定D值，繪制曲線[14，28]。

1.2.4 AuNPs與抗體結合的最佳濃度測定 將納米金pH值調至最適值，各EP管中加入500 μL納米金溶液，之后分別加入0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL濃度為0.5 mg/mL的Nb抗體蛋白，振蕩20 min后室溫放置10 min;然后分別加入50 μL 的10% NaCl溶液，振蕩混合10 min，室溫下放置2 h，于波長520 nm測其D值，繪制曲線[14，28]。

1.2.5 AuNPs探針制備 將50 mL AuNPs溶液調至最適pH值，加入適量Nb抗體蛋白后緩慢搖勻30 min，室溫靜置 30 min;加入10% BSA至終濃度為1%，室溫封閉30 min。12 000 r/min 離心30 min，棄上清，用5 mL稀釋液（20 nmol/L Tris-HCl，1% BSA）將沉淀重懸，4 ℃保存備用。

1.2.6 納米金探針活性及其特異性測定 取10 μL納米探針溶液與5 μL 1 mg/mL Nb總蛋白溶液混合，37 ℃分別孵育30 min、1 h、2 h，觀察各組顏色變化。各取10 μL納米探針溶液，分別加入5 μL不同種類蛋白作為抗原（Nb總蛋白、BSA、BmN 細胞總蛋白），蛋白濃度為1 mg/mL，進行比色檢測。

1.2.7 納米金探針靈敏性測定確定最優反應條件，檢測不同濃度的Nb蛋白樣品（100.0、20.0、2.0、0.5、0.1、0.05、0 μg/mL）。

2 結果與分析

2.1 AuNPs的制備

應用檸檬酸鈉還原法制備的AuNPs溶液呈現酒紅色、透光性好、沒有聚沉。由AuNPs的透射電鏡照片（圖1-A）可見，粒子呈較為規則的球形或近球形，分散均勻;圖1-B為AuNPs的紫外-可見吸收光譜，在523 nm處出現了紫外特征吸收峰，根據納米金最大吸收峰與粒徑存在的線性關系式[29]（y=0.427 1x+514.56，y表示最大吸收峰，x表示納米金粒徑），計算出所制備納米金粒徑約為20 nm。

2.2 Nb總蛋白抗體制備

純化后的Nb多克隆抗體通過ELISA法測定其效價>1 ∶ 512 000，SDS-PAGE檢測顯示，抗體純度在95%以上。Western blot試驗結果（圖2）顯示，Nb總蛋白抗體能夠特異性識別Nb，并且可以同時檢測到Nb的多種蛋白。

2.3 最適標記pH值和最適抗體量

由圖3-A可知，在pH值為8.5時納米金和Nb總蛋白抗體結合情況最佳。由圖3-B可知，500 μL納米金溶液中添加≥5 μL質量濃度為0.5 mg/mL的Nb抗體溶液后的趨勢無明顯變化，表明此時的抗體蛋白已經足夠與AuNPs形成穩定的復合物。

2.4 AuNPs探針活性及其特異性測定

由圖4可知，AuNPs探針檢測Nb總蛋白，混合1 h后，檢測溶液顏色出現明顯變化（由紅色變為紫色），2 h后，檢測溶液顏色逐漸變為藍色。當加入BSA和BmN細胞蛋白時，檢測溶液顏色保持不變。只有檢測物為Nb蛋白時，檢測溶液中納米金才會聚集變色。

2.5 AuNPs比色法靈敏性測定

不同濃度的Nb蛋白樣品（100.0、20.0、2.0、0.5、0.1、0.05、0.0 μg/mL） 與納米金探針混合后，37 ℃下孵育2 h。由圖5可知，當目標檢測物濃度低于2 μg/mL時，檢測液顏色不會明顯改變，因此納米金探針檢測目標物最低濃度為 2 μg/mL，即檢測量為10 ng。

3 討論與結論

在弱堿環境下，AuNPs帶負電荷，易與蛋白質分子的正電荷基團結合。由于這種靜電結合方式不會改變蛋白質的生物活性，因而被廣泛應用到生物檢測領域內[14]。本試驗利用檸檬酸三鈉還原法制備的AuNPs分散均勻，形狀規則，平均粒徑為20 nm，適合進行標記[14，22]。本試驗確定的最佳標記pH值為8.5，這與之前研究報道IgG標記時，AuNPs所用pH值為8.5[14，22]相一致。 AuNPs溶液pH值會顯著影響納米金顆粒與抗體蛋白之間的結合。當AuNPs溶液的pH值等于或略高于蛋白質的等電點時，蛋白質呈中性，此時蛋白質與AuNPs相互間靜電作用力最小，但蛋白質分子表面張力卻最大，處于微水化狀態，易吸附在AuNPs表面，形成蛋白層，阻止AuNPs聚集，從而達到穩定狀態[14，29]。

根據Li等研究報道，AuNPs比色法要求將抗體結合在AuNPs，根據抗原抗體特異性結合，使分散的AuNPs聚集，這表明至少需要2種探針才能確保在檢測單一目標蛋白時AuNPs會聚集[21]。由于本試驗所制備的Nb抗體能夠檢測出多種Nb蛋白，所以在AuNPs比色檢測Nb時就無須制備2種探針，大大降低檢測成本。之前文獻報道，膠體金免疫層析法用于檢測微孢子蟲時會遇到檢測時部分微孢子蟲沉附于樣品墊及結合墊表面，只有懸浮的微孢子到達檢測區[30]。納米金比色法避免以上問題出現，因為此方法檢測樣品為可溶性蛋白，但是納米金比色法也存在Nb蛋白提取費時、損耗問題。本試驗的AuNPs比色法能夠檢測出最低Nb蛋白量為10 ng，須要耗時2 h，這2項指標與Li等的研究報道納米金比色法檢測β-酪蛋白的檢測所需要的最低蛋白量和檢測時間[21]有一定差距，可能是由于目標檢測物不同及靶向蛋白提取時損耗等所致。本試驗為AuNPs比色法在家蠶微孢子蟲檢測中的應用提供了理論基礎，但要在實際檢驗工作中應用，還須要進一步優化試驗條件和試驗方法。

試驗所制備的AuNPs分散均勻，形狀規則，適合進行標記。Nb抗體與AuNPs（20 nm）結合最佳濃度為每500 μL AuNPs溶液中添加5 μL 0.5 mg/mL抗體蛋白，標記最佳pH值為8.5。AuNPs比色法能夠最低檢測出Nb蛋白量為10 ng。

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