植物酸對煙曲霉菌的抑制作用

張婷 徐巖巖 李潔

摘要：為研究植物酸對煙曲霉的抑制作用，以煙曲霉菌為試驗材料，通過測定植物酸的最小抑菌濃度（MIC），以MIC和1/2MIC的植物酸液體培養煙曲霉，觀察煙曲霉菌絲生長和分生孢子頂囊形態變化;并進行轉錄組測序，初步探討其抑菌機制。結果表明，植物酸具有抑制煙曲霉生長的作用，最小抑菌濃度為20 μL/mL。在1/2MIC植物酸培養煙曲霉時，菌絲生長受到抑制，菌絲形態及分生孢子頂囊部分發育不完全。轉錄組測序結果顯示，差異基因代謝通路主要集中在代謝過程，其次是遺傳信息處理。涉及上調基因數目較多的代謝通路主要包括氨基酸生物合成、核糖體、氧化磷酸化和氨酰tRNA生物合成。涉及下調基因數目較多的代謝通路主要是代謝通路，其次是次級代謝產物的生物合成、抗生素生物合成以及星形孢菌素生物合成。推測植物酸可能是通過干擾煙曲霉生長過程中的多個信號通路及多個相關基因的表達而實現抑制作用。

關鍵詞：植物酸;煙曲霉菌;最小抑菌濃度;轉錄組測序;抑菌機制

中圖分類號： S482.2+92 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）12-0287-06

植物酸是制備活性炭過程中產生的煙氣經冷凝回流后收集得到的液體，它的主要成分為酚類和有機酸，同時含有少量無機物[1]。近年來，植物酸廣泛應用于農業、食品等行業。研究表明，植物酸有較好的抑菌作用。寇成等用精制的植物酸進行抑菌試驗，發現它對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種病原菌均有一定的抑制作用[2]。徐巖巖等將植物酸用于平菇細菌性褐斑病防治，試驗結果表明，一定濃度植物酸既能有效控制細菌病害，又能促進平菇菌絲的生長[3]。易允喻等采用D值計算法得出苦杏殼植物酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度[4]。鑒于化學農藥對環境和健康的危害，尋找純天然、安全、綠色的生物農藥迫在眉睫，植物酸是一種純天然殺菌藥物，越來越受到人們重視。

煙曲霉菌是一種常見的病原真菌，對人、畜及作物均有嚴重危害，多采用化學藥劑防治[5-8]，尚未見關于植物酸的抑煙曲霉菌及其抑制機制的研究報道。隨著高通量測序技術的應用，轉錄組測序技術已經用于抑菌機制研究[9-10]。筆者所在實驗室在研究珊瑚狀猴頭菌新品種雪玉松茸（Hericium erinaceus）時，獲得1株內生煙曲霉菌。從保證食品安全，尋找安全、抗真菌活性天然藥物的角度出發，本試驗研究植物酸對煙曲霉菌菌絲生長和分生孢子頂囊形態的影響，并通過轉錄組分析，對植物酸抑制煙曲霉菌的機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物酸由河北綠天生物科技有限責任公司提供;煙曲霉菌為筆者所在實驗室從雪玉松茸食用真菌中分離獲得，經分子鑒定為煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）;陽性藥物氟康唑，購自藥店。

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子懸液的制備 煙曲霉菌在35 ℃恒溫培養箱中培養4 d，用含0.1% 吐溫80的生理鹽水沖洗培養基表面，經無菌紗布過濾除去菌絲，7 000 r/min 離心2 min，棄上清，經無菌生理鹽水洗2次后，離心棄上清，用生理鹽水重懸孢子，用血細胞計數板計數后，調整孢子懸液濃度為100萬～500萬CFU/mL，于4 ℃保存備用。

1.2.2 瓊脂稀釋培養法測定植物酸對煙曲霉的最小抑菌濃度 在PDA固體培養基中加入不同劑量的植物酸，濃度分別為5、10、15、20 μL/mL，待冷卻至室溫后倒平板，于平板中央注入5 μL孢子懸液，同時設立陽性對照組（加氟康唑）和空白對照組（加無菌水），均設置3個平行。35 ℃恒溫連續培養4 d，觀察并記錄菌落直徑，PDA固體培養基中無菌落生長的植物酸濃度即為最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.3 植物酸對煙曲霉菌菌絲質量的影響 采用PDA培養基進行液體培養，加入植物酸，使其終濃度為1/2MIC，加入孢子懸液，以加無菌水的處理為空白對照組，加氟康唑的處理為陽性對照組，均設置3個平行。于35 ℃、130 r/min條件下進行培養，觀察并記錄菌絲球生長情況及培養液顏色變化，培養4 d后，過濾菌絲用無菌水沖洗后，烘干至恒質量，測量菌絲干質量。

1.2.4 植物酸對煙曲霉菌分生孢子梗形態的影響 用牙簽挑取處理組與空白對照組菌絲于載玻片上，用乳酸酚棉藍染色后，置于普通光學顯微鏡下觀察，比較菌絲形態的變化。

1.2.5 轉錄組測序 Trizol法提取終濃度為1/2MIC的植物酸處理組及空白對照組煙曲霉菌總RNA，分別標記為處理組1-1、處理組1-2、處理組1-3，對照組1-1、對照組1-2、對照組1-3（表1）。測定樣品濃度，質檢合格后，送交深圳華大基因科技有限公司進行轉錄組測序，對差異表達基因（DEG）進行基因的木體論（GO）功能及代謝路徑（Pathway）功能分析，分析樣品組間基因表達的差異。

1.2.6 數據分析 數據采用SPSS軟件進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異有統計學意義，每組試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 不同濃度植物酸對煙曲霉菌的抑制作用

在培養基中分別加入5、10、15、20 μL/mL植物酸，以加氟康唑的處理為陽性對照組，以加無菌水的處理為空白對照組。35 ℃培養4 d后，測定煙曲霉菌菌落直徑。發現空白對照組的生長速度顯著（P<0.05）高于植物酸處理組，當植物酸濃度為20 μL/mL時，煙曲霉菌生長完全受到抑制，則 20 μL/mL 為最小抑菌濃度（圖1）。

2.2 植物酸對煙曲霉菌菌絲質量的影響

在液體培養基中， 加入終濃度為1/2MIC的植物酸，以加無菌水的處理為空白對照組，加氟康唑的處理為陽性對照組。接入孢子懸液，于35 ℃、130 r/min條件下培養4 d，測定菌絲干質量，結果見表2。

由表2可知，植物酸處理組菌絲干質量明顯低于空白對照組和陽性對照組，分別為空白對照組和陽性對照組的86%、9.4%，并且與對照組相比，植物酸處理組孢子萌發較晚，且其培養液及菌絲球顏色并未呈現對照組的黑褐色，表明植物酸抑制了煙曲霉菌的生長及色素的合成。

2.3 植物酸對煙曲霉菌菌絲及分生孢子梗形態的影響

由圖2可知，將加入5、10 μL/mL植物酸的處理組與對照組的煙曲霉菌用乳酸酚棉藍染色，顯微觀察煙曲霉菌的菌絲及孢子形態，結果發現植物酸處理組與對照組存在明顯差異。對照組菌絲中分生孢子頭數量較多且孢子頂囊呈圓形產孢數量較多（圖2-A、圖2-B），植物酸處理組中分生孢子頭數量隨植物酸濃度的增加逐漸減少，10 μL/mL植物酸處理組孢子頂囊發育不完全（圖2-E、圖2-F）。

2.4 轉錄組分析

根據差異基因檢測結果，對其GO功能進行分類和富集分析。GO分為生物學過程（biological process）、細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）。結果顯示，在生物學過程中代謝過程（metabolic process）、細胞過程（cellular process）和單一生物過程（single-organism process）富集到較多的DEG; 在細胞組分中細胞（cell）、 細胞組分（cell part）、膜（membrane）、細胞器（organelle）、膜組成（membrane part）等富集到的DEG較多;在分子功能中富集到的DEG較多的是催化作用（catalytic activity）和結合作用（binding）（圖3）。

進一步對GO功能對應的差異基因上調、下調進行分析。結果（圖4）顯示，顯著上調基因主要集中在細胞組分中的細胞（cell）、細胞組分（cell part）、細胞器（organelle）、細胞器組分（organelle part）和大分子復合物（macromolecular complex）;顯著下調基因主要集中在生物學過程中的代謝過程（metabolic process）、細胞過程（cellular process）和單一生物過程（single-organism process），以及分子功能中的催化作用（catalytic activity）、結合作用（binding）、轉運活性（transporter activity）和核酸結合轉錄因子活性（nucleic acid binding transcription factor activity）。

根據差異基因檢測結果，對其進行KEGG生物通路分類以及富集分析，通路分類結果詳見圖5，富集通路對應的差異表達基因上調、下調詳見圖6。差異基因代謝通路主要包括細胞過程（cellular processes）、環境信息處理（environmental information processing）、遺傳信息處理（genetic information processing）、代謝（metabolism）、有機系統（organismal systems）。結果顯示，差異基因代謝通路主要集中在代謝過程，所涉及到的Unigene數目高達3648條。其次是遺傳信息處理，涉及885條Unigene。涉及上調基因數目較多的代謝通路主要包括氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）、核糖體（ribosome）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）和氨酰tRNA生物合成（aminoacy-tRNA biosynthesis）。說明植物酸促使蛋白質合成過程加強。涉及下調基因數目較多的代謝通路主要是代謝通路（metabolic pathways），其次是次級代謝產物的生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、抗生素生物合成（biosynthesis of antibiotics）以及星形孢菌素生物合成（staurosporine biosynthesis）。

3 討論與結論

植物酸是一種純天然殺菌藥物，對植物病原菌、霉菌和細菌均有很好的生長抑制活性[11-14]，本研究結果表明，植物酸能夠改變煙曲霉菌的菌絲形態，減少或抑制孢子的生成和產率，從而抑制煙曲霉菌的生長。應用轉錄組測序技術對植物酸處理抑制煙曲霉菌生長的樣品進行研究，差異表達基因GO功能分析結果顯示，涉及上調基因數目較多的代謝通路主要包括氨基酸生物合成、核糖體、氧化磷酸化和氨酰tRNA生物合成。推測可能是植物酸的有效成分導致蛋白質受損，從而代償性地促進煙曲霉菌蛋白質的合成過程以滿足其生長需要。下調基因主要集中在生物學過程中的代謝過程、細胞過程和單一生物過程。涉及差異基因下調數目較多的生物通路主要集中在代謝通路、次級代謝產物的生物合成。推測植物酸中含有的酸類、酚類等活性物質可能是通過滲透的方式進入煙曲霉細胞內，干擾這些信號通路及相關基因的表達，從而抑制煙曲霉生長。同時發現星形孢菌素生物合成通路中相關基因明顯下調，最終減少煙曲霉菌毒素的合成，這一結果解釋了加入植物酸液體培養煙曲霉菌時，色素量明顯下降的現象。

總之， 植物酸能抑制煙曲霉菌菌絲生長和分生孢子囊的形成，在煙曲霉生長過程中，植物酸通過干擾多個相關基因，致使多個信號通路受到影響，從而達到抑制煙曲霉菌的作用。植物酸的抑菌作用可能是乙酸、酚類和糠醛等多種成分共同作用的結果[15-17]，具體機制還有待于進一步研究。

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