不動桿菌JL-1降解磷的性能研究

李文 莫港澳 孫欣

摘要：以不動桿菌（Acinetobacter indicus）JL-1為菌種，使用無機磷液體培養基測定其解磷性能。采用單因素試驗與正交試驗確定最佳解磷條件：碳源為10.0 g/L蔗糖，2.0 g/L復合氮源（硫酸銨與酵母粉質量濃度比為1 ∶ 1），pH值為7.5，溫度為37 ℃，裝液量為50 mL/250 mL。在此最優條件下，解磷量在48 h時最高，為61.02 μg/mL，菌落數為2.69×1011 CFU/mL，發酵過程中pH值呈先下降后略上升的趨勢。通過對其解磷機制進行初步研究，確定此菌株以酸解為主、酶解為輔的方式來解磷。

關鍵詞：解磷菌;不動桿菌;正交試驗;解磷性能;解磷機制

中圖分類號： S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）12-0311-05

磷元素是植物成長進程中的一種重要元素[1]，廣泛地參加植物細胞內多種生理生化進程，能夠顯著有效地促進植物生長發育和新陳代謝過程[2]。我國大約有74%的耕地缺磷，并且土壤中的絕大部分磷是無效磷，植物難以吸收使用[3-4]，而施用磷肥又會對環境和經濟造成不良的影響[5]。土壤中存在大量的解磷菌，包括細菌、放線菌和酵母菌，它們能將難溶性的磷轉化為農作物可吸收利用的可溶性磷，促進農作物生長，改善土壤環境，顯著提高土壤中的有效磷含量，因此，解磷菌的研究與應用對于農業生產具有重要的理論和實踐意義，有助于緩解我國土壤磷素缺乏和環境污染問題。

影響解磷微生物解磷性能一方面是由于解磷微生物自身的遺傳特性差異，除此之外，諸多物理化學因素也對解磷微生物分解磷化合物產生重要影響，例如土壤中磷素的種類和含量、酸堿度、溫度、土壤成分等因素。解磷微生物獲得的碳、氮營養通過影響微生物的生長和代謝過程，也可以影響微生物對土壤中磷化合物的分解。許多學者通過對解磷菌株在多種碳氮源下的解磷能力進行測定，考察能量來源對微生物解磷效應影響的大小，并尋找最優碳氮源。趙小蓉等研究了解磷微生物培養基中碳源、氮源以及碳氮比對于解磷微生物解磷的影響，認為解磷微生物生長代謝受碳源、氮源以及碳氮比影響，其中突出表現為解磷菌代謝產生的有機酸受此影響很大[6]。

解磷菌的解磷過程是個復雜的過程，解磷機制比較復雜，解磷能力也表現出差異。有些微生物在土壤缺磷的情況下，向外分泌植酸酶、核酸酶、磷酸酶等，將無效磷轉化為有效形式[7-8]。還有些微生物解磷與其產生的有機酸有關，這些有機酸能夠降低pH值，與鐵、鋁、鈣、鎂等離子結合，從而使難溶性的磷酸鹽溶解[9-11]。而有些菌株這2種機制都存在，在其解磷過程中共同作用，從而導致難溶磷的溶解[12]。每種解磷微生物解磷的方式各不相同，具有明顯的特異性。

本研究對前期篩選所得的不動桿菌JL-1進行解磷性能初步測定，通過對培養基及條件進行優化以提高解磷菌的解磷性能，繼而初步探究其解磷機制，以期為利用此解磷菌用于微生物肥料生產提供技術支持和理論支撐，對農業生產具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

土壤中篩選出的不動桿菌（Acinetobacter indicus）JL-1，保藏于徐州工程學院微生物遺傳育種實驗室。

1.2 儀器與設備

723C可見分光光度計HYG（上海欣茂儀器有限公司）、旋式恒溫調速搖瓶柜（上海欣蕊自動化設備有限公司）、DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）、HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）。

1.3 培養基

1.3.1 無機磷液體培養基 10.00 g葡萄糖、25.00 g Ca3（PO4）2、0.50 g（NH4）2SO4、0.20 g NaCl、0.20 g KCl、0.10 g MgSO4·7H2O、0.03 g FeSO4·7H2O、0.03 g MnSO4·4H2O、0.50 g酵母粉，1 000 mL水，pH值為6.8～7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 LB液體培養基 5.00 g蛋白胨、5.00 g NaCl、2.50 g牛肉浸膏、500 mL蒸餾水、pH值在7.0左右，121 ℃滅菌20 min。

1.3.3 LB固體培養基 LB液體培養基中加入瓊脂粉，使其濃度為18 g/L。

1.4 試驗方法

1.4.1 斜面活化 將實驗室保存的不動桿菌JL-1轉接至已滅菌的LB斜面，置30 ℃恒溫培養箱活化培養24 h。

1.4.2 種子液制備 用接種環刮取斜面菌株接入100 mL LB液體培養基中，于30 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中培養 24 h 得種子液。

1.4.3 液體發酵檢測菌株解磷能力 以1%（體積比）接種量將種子液接入無機磷液體培養基中，裝液量為 100 mL/250 mL，于30 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中培養48 h，發酵液于8 000 r/min離心15 min，檢測上清液中的磷含量，以不接菌的處理作為對照。采用磷鉬藍比色法測定磷含量[13]。

1.4.4 菌株JL-1最適解磷條件研究

1.4.4.1 單因素試驗 選取不同濃度碳源（葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、羧甲基纖維素鈉）、不同濃度氮源（硫酸銨、草酸銨、硝酸鉀、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨）、初始pH值（5.5、6.5、7.0、7.5、8.5）、溫度（25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃）、裝液量（30、50、80、100、120 mL），測定其對菌株JL-1解磷能力的影響。

1.4.4.2 正交試驗 在單因素試驗基礎上，選取碳源濃度、氮源濃度、初始pH值、溫度等4個較為顯著的影響因素，采用L16（34）正交表進一步研究這4個因素對菌株JL-1解磷能力的影響，因素水平見表1。

1.4.5 菌株JL-1解磷曲線 將菌株JL-1在最佳發酵條件下連續培養72 h，從0 h起，每12 h取樣1次，測定菌落數、pH值及解磷量。采用稀釋涂布法測定菌落數，將發酵液用無菌水準確稀釋至10-8、10-9、10-10，用涂布棒緩慢均勻地涂布在準備好的LB固體培養基上，每個稀釋度做3個平行，48 h后計數平板上的菌落數，取3組平行的平均值。

1.4.6 菌株JL-1解磷機制 將菌株于最佳條件下培養 48 h 后，使用細菌過濾器將發酵液過濾除菌，作以下4種處理：（1）置于121 ℃滅菌5 min使酶類失活，以測定過濾液中各種有機酸類對磷酸鈣的溶解效果;（2）在無菌條件下調節pH值至7.0，以消除濾液中各類有機酸的影響，測定濾液中酶類對磷酸鈣的溶解作用;（3）既不調節pH值，也不做滅活處理，以測定濾液中酶類和有機酸對磷酸鈣的共同作用;（4）設置對照（CK），即滅活并調節pH值。上述4種處理各 50 mL，與50 mL新鮮的無機磷培養基混合后，置于37 ℃、150 r/min 的恒溫振蕩器中振蕩培養48 h，測定上清液中的磷含量。同時，將 100 mL 無機磷培養基裝入錐形瓶中，用鹽酸分別調節培養基pH值為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5，置于37 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中振蕩培養48 h后，測定上清液中的磷含量。

2 結果與分析

2.1 碳源對菌株JL-1解磷能力的影響

2.1.1 不同碳源對菌株解磷能力的影響 碳源是微生物生長過程中所必需的一種養分，微生物對不同碳源的利用能力不同導致其生長及代謝速度不同，從而影響菌株的解磷能力。由圖1可知，菌株JL-1在以蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖為碳源時，具有較強的解磷能力，且以蔗糖為碳源時解磷能力最好。這表明菌株JL-1能夠較好地利用蔗糖，且蔗糖的成本低于葡萄糖，有利于大規模發酵。因此，確定最佳碳源為蔗糖。

2.1.2 碳源濃度對菌株JL-1解磷能力的影響 由圖2可知，解磷量隨蔗糖濃度的增大呈先升高后下降的趨勢，當蔗糖濃度為15 g/L時解磷效果最好。

2.2 氮源對菌株JL-1解磷能力的影響

2.2.1 不同氮源對菌株解磷能力的影響 氮是構成微生物重要生命物質蛋白質、核酸等的主要元素，是微生物生長的主要營養物[14]。由于微生物對不同氮源的吸收轉化及利用能力不同，選擇最佳的氮源能有效地提高解磷菌的解磷能力。由圖3可知，使用單一氮源時，有機氮源酵母粉最佳，解磷量為51.35 μg/mL，無機氮源硫酸銨最佳，解磷量為 29.40 μg/mL，這與楊慧等的研究結果[15]一致。采用硫酸銨與酵母粉等質量濃度復合，與單獨使用這2種氮源進行比較，由圖4可知，2種氮源復合時解磷量最高為54.15 μg/mL，優于單一氮源的解磷量。因此，菌株JL-1的最優氮源為酵母粉和硫酸銨組成的復合氮源。

2.2.2 氮源濃度對菌株JL-1解磷能力的影響 影響微生物代謝的一個重要因素是碳氮比，因此不同的氮源濃度對菌株解磷能力有很大影響。由圖5可知，氮源濃度在0.5～1.5 g/L 范圍內，解磷量逐漸增加;氮源濃度在1.5～2.5 g/L范圍內，解磷量逐漸下降，因此，解磷菌JL-1的最適氮源濃度為1.5 g/L。

2.3 初始pH值對菌株解磷能力的影響

pH值除了直接影響微生物細胞以外，還對細胞產生一些間接影響，例如pH值能夠使生物細胞膜上所帶的大量電荷發生改變，嚴重影響細胞吸收的營養物的離子化程度，致使微生物細胞吸收營養物質的能力發生極大改變[16]。因此，確定合適的初始pH值，有利于提高解磷的能力和效率。由圖6可知，初始pH值在5.5～7.0之間解磷量逐漸增加;初始pH值在 7.0～8.5之間解磷量逐漸下降，因此解磷最適pH值為7.0，偏酸或偏堿均不利于菌株進行解磷。

2.4 溫度對菌株JL-1解磷能力的影響

溫度為影響微生物生長和代謝環境條件中的重要因素之一，當溫度在微生物能夠適應的最適范圍內緩慢變化時，它的生長和代謝也會同時發生相應的變化。若外界環境超過這個溫度范圍，就會導致該生物生長發育困難和代謝水平急劇下降。由圖7可知，在25～30 ℃之間，隨著溫度升高解磷量逐漸升高，在30～40 ℃之間解磷量逐漸降低，由此可以確定菌株最適解磷溫度為30 ℃。此時菌株生長代謝旺盛，有利于對磷酸鈣的降解。

2.5 裝液量對菌株JL-1解磷能力的影響

絕大多數微生物生長發育及其代謝過程中須要消耗氧氣，因此培養液中的溶解氧也會對菌體的生長代謝有一定的影響，進而影響菌體的解磷能力。裝液量在30～120 mL范圍內變化時，解磷量呈先升后降的趨勢，當裝液量為50 mL時，解磷效果最好，當溶解氧減少時菌株解磷效果漸差，表明解磷菌好氧。在裝液量為30 mL時，雖然菌體與空氣接觸的機會大，但可能是由于裝液量太少，在搖床中培養時，菌體與搖瓶之間的劇烈撞擊對菌體造成些許不良影響，影響到菌體的解磷，導致解磷量較50 mL時有所下降[17]。

2.6 正交試驗確定解磷最佳條件

選取解磷過程中的主要影響因素（碳源濃度、氮源濃度、溫度、初始pH值）進行正交試驗，結果見表2。由k值可以看出最優組合為A1B3C3D3，該組合在正交試驗的9組試驗中的解磷量也最高，由此確定菌株JL-1的最適解磷條件：碳源濃度為10.0 g/L，復合氮源（硫酸銨與酵母粉質量濃度比為 1 ∶ 1）濃度為2.0 g/L，初始pH值為7.5，溫度為37 ℃，裝液量為50 mL/250 mL。從R值看出4個因素對解磷量的影響表現為氮源濃度>碳源濃度>溫度>pH值，這與方差分析結果是一致的，由表3可以看出，氮源濃度對菌株JL-1解磷能力的影響是顯著的（P<0.05），這表明相對于其他3個因素，氮源濃度是影響菌株解磷能力的最主要因素。