基于抗氧化與抗菌實驗探討紫蘇浴足包的使用方法※

井波鑫，張 彥，王 森，武選民

（1.西安醫學院，陜西 西安 710021；2.陜西省西安市冶金醫院，陜西 西安 710077；3.陜西省西安風吹麥浪農產品技術開發有限公司，陜西 西安 710065）

紫蘇為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的干燥葉、莖、干燥成熟果實[1]。一年生草本，分布于中國、不丹、印度、印度尼西亞、日本、朝鮮等國家。我國各地廣泛栽培。紫蘇既是傳統中藥又是藥食兩用佳品。紫蘇莖梗、葉及果實均可入藥，紫蘇葉發汗、解毒，治感冒；紫蘇梗有寬胸理氣、安胎之功；紫蘇子能鎮咳、祛痰、平喘[2]。食品中用紫蘇葉可增加肉類的香味，其辛香氣味的主要來源為揮發油，已從紫蘇揮發油提取物中分離出紫蘇醛、紫蘇醇、薄荷酮、薄荷醇、丁香油酚、白蘇烯酮等活性成分[3]。紫蘇子榨出的蘇子油可供食用，又有防腐作用，在工業與畜牧生產中廣泛應用[4]。中藥浴足包為中藥外洗劑，是用于殺蟲止癢的中醫治療產品。目前市場上的浴足包以苦參等中藥飲片或硫黃等礦物原料為主成分。本研究所用的紫蘇浴足包以紫蘇中藥飲片加工凈選和食品加工時的殘葉、花托等廢棄物為主要原料，輔以柴胡、丹參等地上部分。該浴足包實際用于煎煮或浸泡后外洗，但其煎煮浸泡的具體方法并未十分清楚，本研究從抗氧化劑抗菌研究方面為其使用提供科學依據。

1 材料

1.1 材料與試劑 紫蘇浴足包（楊凌子蘇生物科技有限公司，執行標準Q/0934szzz001-2020）；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門桿菌、銅綠假單胞菌均由西安醫學院醫學技術系微生物檢驗實驗室提供。M-H瓊脂培養基（上海科瑪嘉微生物技術有限公司，批號20201203，直徑90 mm）；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，成都艾科達化學試劑有限公司）；ABTS[2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽，成都艾科達化學試劑有限公司]；阿莫西林膠囊（哈藥集團制藥總廠，國藥準字H23020932）；抗壞血酸、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、無水乙醇等（均為分析純，購自天津科密歐化學試劑有限公司）。

1.2 儀器及設備 Read Max 1900/1900Plus型酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）、D3024R型臺式高速（冷凍型）微量離心機[大龍興創實驗儀器（北京）股份有限公司]、SXKW數顯控溫電熱套（北京市永光明醫療儀器廠）、H H-S6型電熱恒溫水浴鍋（上海羌強儀器設備有限公司）、KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、旋轉蒸發器（上海申生科技有限公司）、SQP分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）、BOV101-70-Ⅱ型鼓風干燥箱（中華人民共和國上海市實驗儀器總廠）、96孔板（廣州潔特生物過濾制品有限公司）等。

2 方法

2.1 紫蘇浴足包樣品提取液的制備 紫蘇浴足包浸泡法提取液:取1袋紫蘇浴足包（20 g）在1 L 100℃的蒸餾水中浸泡，10 min后過濾獲得浸泡法提取液，放至常溫。紫蘇浴足包煎煮法提取液:取1袋紫蘇浴足包（20 g）在1 L 100℃蒸餾水中煎煮，5 min后過濾獲得煎煮法提取液，放至常溫。兩種紫蘇浴足包提取液濃度約為0.02 g/m L。

2.2 紫蘇浴足包的抗氧化活性測定[5-7]

2.2.1 DPPH自由基清除率的測定 將兩種樣品提取液分別與0.3 mmol/L DPPH溶液混合均勻，室溫避光反應30 min。采用酶標法進行測定吸光度，于517 nm處測吸光值。蒸餾水與DPPH溶液混合反應作為陰性對照；抗壞血酸與DPPH溶液混合反應作為陽性對照。每組實驗平行測3次，取平均值并求方差。DPPH自由基清除率的計算公式如下:

DPPH自由基清除率＝[（A陰－A測）/（A陰－A陽）]×100%。式中A測、A陰、A陽分別為樣品、陰性對照、陽性對照的吸光度。

兩種紫蘇浴足包提取液分別定至0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 g/m L，測定各濃度下 DPPH 自由基清除率，并計算半抑制濃度（IC50）值。

2.2.2 ABTS自由基清除率的測定 取3.840 g ABTS粉末溶于1 L無水乙醇中，得到7 mmol/L ABTS無水乙醇溶液。取5.406 4 g過硫酸鉀粉末溶于1 L蒸餾水中，得到20 mmol/L過硫酸鉀水溶液。將ABTS無水乙醇溶液與過硫酸鉀水溶液混合，避光常溫反應12～16 h。將反應后的混合溶液用無水乙醇稀釋，在743 nm處調試吸光度，使混合溶液吸光度為（0.30±0.02），此為 ABTS工作液。分別取0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 g/m L紫蘇浴足包浸泡法提取液和煎煮法提取液6μL，分別與194μL的ABTS工作液混合，避光反應6 min，于734 nm波長處測定吸光度。將無水乙醇與ABTS工作液混合反應作為空白組；樣品提取液與蒸餾水混合反應作為對照組。每組實驗平行測3次，取平均值并求方差。ABTS自由基清除率的計算公式如下:

ABTS清除率＝[1－（Ai－Ai0）/A0]×100%。式中A0、Ai0、Ai分別為空白組、對照組、樣品組的吸光度。

2.2.3 羥自由基清除率測定 取1.241 g水楊酸粉末溶于1 L無水乙醇中，得到9 mmol/L水楊酸-無水乙醇溶液。取1.367 g硫酸亞鐵粉末溶于1 L無水乙醇中，得到9 mmol/L硫酸亞鐵溶液。取紫蘇浴足包浸泡法提取液、紫蘇浴足包煎煮法提取液各0.4 m L，分別依次加入0.4 m L 9 mmol/L硫酸亞鐵、0.4 m L 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和0.4 m L 9.9 mmol/L過氧化氫溶液，37℃下水浴30 min，取混合溶液200μL于510 nm波長下測定吸光度。將加入樣品的量替換成蒸餾水作為空白組；將加入過氧化氫的量替換成蒸餾水作為對照組。每組實驗平行測3次，取平均值并求方差。羥自由基清除率的計算公式如下:

從圖5、圖6和圖7所示的特征結果可以看出，在旋轉整流器正常工作、單管開路故障和雙管開路故障3種情況下，相同信號分量計算獲取的能量值差異較明顯，因而可利用上述獲取的故障特征參數對同步交流發電機旋轉整流器實施故障診斷操作。

羥自由基清除率＝[（1－（A2－A1）/A0]×100%。式中A0、A1、A2分別為空白組、對照組、樣品組的吸光度。

2.3 紫蘇浴足包的體外抑菌活性測定[8-9]對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門桿菌、銅綠假單胞菌進行體外抑菌實驗。先制備瓊脂平板若干（1種菌只需制備1個平板），取菌液0.2 m L涂布均勻，制成帶菌瓊脂平板。用打孔器打出6 mm直徑的濾紙片，并浸泡在各消毒劑樣品溶液中。陽性對照浸泡于阿莫西林水溶液中。在37℃環境下培養24 h并觀察抑菌圈的大小以判定消毒劑敏感度和后續生長情況。對有效配方制作濃度梯度判斷是否具有量效關系。

2.4 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件處理數據，采用Origin 8.5軟件作圖。

3 結果

3.1 紫蘇浴足包的抗氧化活性結果

3.1.1 DPPH自由基清除率的測定結果 不論是用浸泡法還是煎煮法的紫蘇浴足包都有一定的抗氧化活性，其中煎煮法清除DPPH較好。同一煎煮時間下，在0.02～0.08 g/m L濃度下，紫蘇浴足包濃度越高抗氧化活性越好。在0.08～0.32 g/m L濃度下，紫蘇浴足包濃度越高而抗氧化活性越差。見表1。最佳濃度為0.053 g/m L，最高清除率為58.11%。見圖1。紫蘇浴足包煎煮法DPPH自由基清除率的IC50值為35.515 mg/m L。

表1 兩種使用方法的紫蘇浴足包樣品不同濃度DPPH自由基清除率結果比較(%)

3.1.2 ABTS自由基清除率、羥自由基清除率 煎煮法ABTS自由基清除率較好，而浸泡法的羥自由基清除率較高。見表2。

表2 兩種使用方法的紫蘇浴足包樣品的ABTS自由基清除率、羥自由基清除率比較(%)

3.2 紫蘇浴足包的體外抑菌活性檢查結果 紫蘇浴足包浸泡法僅在0.02 g/m L濃度時對金黃色葡萄球菌有抑菌活性，而對大腸桿菌、銅綠假單胞菌和沙門桿菌無效。紫蘇浴足包煎煮法僅對金黃色葡萄球菌有抑菌活性，且呈現一定的量效關系，濃度越大，抑菌活性越低。見表3。

表3 兩種使用方法的紫蘇浴足包樣品不同濃度對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、沙門桿菌的抑制情況比較(mm)

4 結論

中醫認為，紫蘇葉有發汗、解表散寒的功效，紫蘇梗有寬中利氣的作用。有文獻提及，藿香正氣方中的紫蘇等成分有抑制葡萄球菌作用[10]。紫蘇浴足包所取紫蘇為地上部分，包括葉、梗、花托等，均打粉入藥。本次實驗結果可知，無論是浸泡法還是煎煮法，紫蘇浴足包有一定的抗氧化活性和抑菌活性，推斷可能是紫蘇地上部分中的黃酮、酚酸、揮發油等成分發揮作用。紫蘇浴足包外用可抵抗氧自由基減少引起的足部皮膚的衰老，保護足部皮膚，抑制皮膚致病菌引起的足部病變。

總之，紫蘇浴足包煎煮法抗氧化活性要優于浸泡法，煎煮法抑菌活性優于浸泡法。本研究煎煮時間在5 min，最佳濃度為0.053 g/m L左右。紫蘇浴足包對人體皮膚主要的革蘭氏陽性致病菌中的金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用，提示臨床可將紫蘇浴足包應用于金黃色葡萄球菌引起的皮膚感染疾病，如膿包病、毛囊炎等[11]。

綜上所述，本實驗為紫蘇浴足包的使用方法提供了有效的依據。紫蘇浴足包最佳使用方法為煎煮法:用1 L 100℃的蒸餾水煎煮5 min后，再添加適量溫水至合適水溫使用。紫蘇浴足包具有一定的抗氧化和抑菌活性，可使人體足部皮膚光滑，并起到抗衰老和殺菌消毒的作用。本研究目前只做了抗氧化活性實驗，后續可對抗炎活性與機制進行進一步研究。人體足部皮膚病也可能是由真菌感染引起的，因時間有限，本研究未能完成對真菌的觀察，后期將繼續研究。此外，今后還將對浴足包進行劑型改進，如浴足液或泡騰片可直接加入至溫水中，省去煎煮步驟，力求使用更加方便；對紫蘇浴足包助睡眠、預防高血壓等方面進一步研究與開發。