共培養微藻Monoraphidium sp. eh1和Monoraphidium sp. eh3提高油脂產率和沉降率

肖鈞木，趙飛燕，崔 娜，丁 巍，余旭亞，徐軍偉，趙 鵬

(昆明理工大學 生命科學與技術學院，昆明 650500)

由于傳統化石燃料的日漸衰竭和環境問題的日益緊張，對可再生環境友好型能源的探索需求也越來越迫切[1]。以微藻油脂為原料的第三代生物柴油是一種對環境無污染且可再生的新型生物能源，在技術上已經可以進行生產，但由于成本較高，尚未實現大規模工業化。微藻產油的關鍵在于提高油脂產率和降低采收成本，較低的油脂產率是微藻產油相對于傳統化石燃料的劣勢[2]，目前還未能得到很好的解決；而較高的采收成本制約著微藻生物柴油的工業化生產。據相關研究[3]表明，微藻生物柴油的采收成本占總生產成本的20%～30%。因此，提高油脂產率和降低采收成本，是實現大規模工業化微藻產油的當務之急。

現有提高油脂產率的方法包括基因敲除[4]、添加誘導劑[5]、非生物脅迫、添加金屬離子[6]、發酵罐培養和跑道池培養等。采收方法有離心法、沉降法、過濾法和絮凝劑法等[7]。但是在微藻合成油脂和微藻采收方面，這些方法存在著能耗高、效率低、需增加額外的設備、前期投入較大、成本高等缺陷。

有研究[8]表明，共培養能使培養體系內的兩種微藻間產生競爭關系，促進油脂的合成，進而提高油脂含量和油脂產率，并且具有能耗低、效率高、成本低和污染小等優點。微藻細胞較小，細胞表面帶負電荷，細胞間相互排斥，難以聚集形成絮凝沉淀，自然沉降收集微藻細胞較為困難[9]。通過調節培養后體系的pH，能夠降低微藻細胞表面電勢，有效促進細胞間的聚集，加速細胞的沉降，便于微藻細胞的采收[3,10]。本文對兩株單針藻Monoraphidiumsp. eh1和Monoraphidiumsp. eh3進行共培養，對油脂產率及絮凝效率進行研究，以期找尋一種同時兼顧提高油脂產率及促進細胞絮凝沉降的方法，為微藻生物柴油的大規模工業化生產提供可行的應用思路和一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

單針藻Monoraphidiumsp. eh1(簡稱eh1)和Monoraphidiumsp. eh3(簡稱eh3)，均從云南省高原淡水湖洱海(N25°36′～25°58′，E100°06′～100°18′)水樣中分離得到，純化培養后經18S rRNA比對并結合形態學分析鑒定為單針藻。BG-11培養基，調整pH至7.0后121℃高壓滅菌20 min備用。

TS-1102恒溫(恒濕)振蕩搖床，JS94H Zeta電位分析儀，5810R高速冷凍離心機(德國)，Agilent 7890氣相色譜儀，Specord Plus分光光度儀，VITLAB英霍夫沉降管(德國)，LDZX-50KBS滅菌鍋，FA2004N分析天平，HHW-D6水浴鍋，磁力攪拌器。實驗所用試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 微藻培養

在含有300 mL培養基的500 mL錐形瓶中，接種單針藻eh1與單針藻eh3，初始細胞濃度均為2.00×106個/mL，在恒溫搖床進行共培養，控制培養條件為培養溫度25℃、轉速150 r/min、光照強度3 500 lx。另外，分別接種eh1、eh3進行單獨培養，初始細胞濃度均為4.00×106個/mL。

1.2.2 生物量和比生長速率測定

取培養至穩定期的藻液，于13 000g離心5 min，去上清，去離子水反復洗滌沉淀3次得濕藻體，冷凍干燥后稱重計算生物量及生物量產率。生物量=干藻質量/藻液體積，生物量產率=生物量/培養時間。

使用血球計數板測量細胞濃度，取接種當天和培養結束時的細胞濃度計算比生長速率[11]。

1.2.3 油脂提取

培養至穩定期的藻液轉移至離心管內，于8 000g離心5 min，去掉上清，將濕藻體放入-80℃冰箱中冷凍過夜后，凍干機上樣冷凍干燥36 h，得到干藻粉。油脂提取采用Bligh & Dyer法[12]。稱取干藻粉0.2 g、石英砂0.4 g，于研缽中研磨至細胞充分破碎油脂釋放，將藻粉轉移至5 mL EP管，向研缽中加入3 mL氯仿-甲醇以混合殘留的藻粉，并轉移到已裝有干藻粉的EP管中，然后放置于搖床上，室溫、100 r/min振蕩提取20 min后，于2 000 r/min離心10 min收集溶劑相，剩余沉淀再用氯仿-甲醇重復提取2次，然后合并3次提取的溶劑相，40℃烘干48 h，冷卻至室溫后稱重，計算油脂含量和油脂產率。

油脂含量=W1/W0×100%

油脂產率=W0×C/(V×T)

式中：W1為提取的油脂質量，mg；W0為藻粉干重，mg；C為油脂含量；V為藻液體積，L；T為培養時間，d。

1.2.4 脂肪酸組成分析及相關指標測定

將提取的油脂約100 mg加入2 mL 3%硫酸-甲醇充分混合，70℃水浴冷凝回流4 h，加入2 mL正己烷后置于搖床上，室溫、100 r/min振蕩萃取4 h，靜置后取上清用0.45 μm有機相濾膜過濾，得到的脂肪酸甲酯(FAMEs)[13]進行GC-MS分析[11]。計算得單一脂肪酸對應十六烷值(CN)，根據脂肪酸組成再經過組合模型估測生物柴油的十六烷值[14]。

1.2.5 硝酸鹽質量濃度測定

采用比色法測定藻液中胞外硝酸鹽的質量濃度。取1 mL微藻培養基混合液，在13 000g下離心5 min，取100 μL上清液，與400 μL 5%的水楊酸-H2SO4溶液混溶，于室溫反應20 min，緩慢加入9.5 mL 2 mol/L NaOH溶液，靜置冷卻至室溫后，在410 nm處測量吸光度，計算硝酸鹽質量濃度。

1.2.6 微藻沉降

單獨培養及共培養藻液分別培養至穩定期，在自然條件和調節pH(利用1 mol/L HCl將培養后藻液pH調節至7.0)后進行沉降率測定，并與單獨培養后添加絮凝劑的沉降率結果進行比較。

將自然條件、調節pH、添加絮凝劑的藻液轉移至英霍夫沉降管(Imhoff Cones)[15]，沉降30 min，微藻液面下5 cm處取樣，于750 nm、1 cm光程進行比色，計算沉降率(η)[16]。

η=(OD0-OD1)/OD0×100%

式中：OD0為開始沉降時藻液的光密度；OD1為沉降30 min時藻液的光密度。

1.2.7 統計分析

所有實驗樣品設置3組平行，所得實驗數據采用Minitab軟件進行分析。最小顯著性差異進行多重比較檢驗研究不同實驗的組間差異，且當p<0.05具有顯著性意義，p<0.01具有極顯著性意義。

2.3 不同TSH水平與TG及LDL-C的相關性分析 為進一步分析不同TSH水平與脂質代謝之間的相關性，將女性亞臨床甲減人群以TSH 10 mIU/L為分界進行分層，并對不同TSH水平與TG及LDL-C的相關性進行Logistic回歸分析，結果顯示，TG水平與TSH水平顯著相關，尤其是TSH>10mIU/L時TG升高的風險明顯增加(β=1.84、OR=4.96、95%CI為1.83～13.51、P=0.002)，4.2 mIU/L

2 結果與分析

2.1 生長特性

不同培養體系的微藻生長曲線及硝酸鹽消耗情況見圖1。

由圖1A可以看出，所有微藻生長均未出現明顯的停滯期，用于接種的種子液狀態良好，實驗未出現雜菌污染現象。eh1單獨培養26 d細胞濃度達到27.9×106個/mL；eh3單獨培養26 d細胞濃度達到47.8×106個/mL；而eh1和eh3共培養20 d細胞濃度達到40.0×106個/mL。這是由于eh1和eh3共培養產生了環境內競爭關系，更快地消耗了培養基中的營養物質，在較短的時間進入了穩定期，縮短了生長周期和培養時間。由圖1B可以看出，不同培養體系中的硝酸鹽幾乎都被耗盡，對比單獨培養體系和共培養體系，共培養體系在16 d時已經消耗絕大部分硝酸鹽，此時eh1單獨培養體系中還剩余47%的硝酸鹽，eh3單獨培養體系中則為17%，這表示共培養體系更早地出現了氮缺陷現象從而進入了氮限制狀態。這種情況的產生可能與共培養有關，共培養使得兩種微藻產生了競爭關系，誘導其各自產生了單獨培養下不會發生的代謝途徑，產生了不同于單獨培養下的代謝產物，在此過程中硝酸鹽消耗速率提升。因此，共培養是一種可以縮短微藻生長周期及培養時間的培養方法。

2.2 油脂產率

微藻油脂生產能力是衡量微藻是否具備生物柴油生產能力的依據。一般油脂含量較高的微藻生物量較低，而生物量較高的微藻油脂含量較低[17]。本實驗綜合考量以上兩個指標，選取油脂產率作為評價微藻油脂生產能力的標準。eh1和eh3單獨培養26 d及共培養20 d的油脂產率見表1。

表1 Monoraphidium sp. eh1和Monoraphidium sp. eh3

由表1可以看出，eh3單獨培養的生物量產率最低，共培養生物量產率最高，eh1單獨培養的油脂含量最低，共培養的油脂含量最高，eh3的油脂產率最低，共培養的油脂產率最高。由于共培養氮源消耗較快而進入了氮限制狀態，已有的研究[18]表明，氮限制能增加脂肪酸?；鵆o-A的細胞內含量并激活二?；视王；D移酶，將脂肪酸?；鵆o-A轉化為甘油三酯，當微藻處于低氮含量培養基中時，其油脂含量會高于較高氮含量培養基中的微藻[19]，同時共培養縮短了培養時間，最終使得其油脂產率相較于單獨培養有了很大的提升。

2.3 脂肪酸組成

本實驗就各種培養體系獲得的油脂進行了脂肪酸組成分析。另外，由于在沉降實驗時對藻液pH進行了調節，為了明確pH是否會對油脂質量產生影響，將共培養的藻液調節pH(7.0)后進行了油脂的提取，并進行了脂肪酸組成分析，結果見表2。

表2 Monoraphidium sp. eh1和Monoraphidium sp. eh3單獨培養及共培養微藻油脂脂肪酸組成及含量 %

2.4 微藻的沉降

沉降率是衡量微藻采收效率的標準之一，較高的沉降率表示在短時間內可以實現高效的采收。已有的提高微藻采收效率的方法中，添加絮凝劑是一種有效的手段。本實驗對單獨培養26 d的eh1和eh3添加不同種類和劑量的絮凝劑，并測定沉降率，結果見表3。

表3 Monoraphidium sp. eh1和Monoraphidium sp. eh3添加絮凝劑的沉降率

從表3可以看出，添加絮凝劑對eh1和eh3沉降率都有顯著的提升。在已有的研究[20-22]中，添加絮凝劑是促進沉降的有效方法。在對小球藻(UTEX 265)的研究中[18]，添加400 mg/L FeCl3沉降率可達80%左右，低于本實驗添加同等濃度FeCl3的eh3的沉降率92.85%，但添加600 mg/L FeCl3的沉降率最高為95%[18]，高于本實驗添加同等濃度FeCl3的eh1的沉降率90.47%，而添加200 mg/L明礬的沉降率最高為20%[18]，本實驗添加同等濃度明礬的eh1和eh3沉降率分別為90.46%和91.77%。在對螺旋藻(Spirulina)、小球藻(Chlorella)、顫藻(Oscillatoria)和藍藻(Synechocystis)的研究[19]中，添加15 mg/L殼聚糖的沉降率最高為92%，低于本實驗添加同等濃度殼聚糖的eh1的沉降率96.86%，但高于未出現沉降效果的eh3。在對柵藻(Scenedesmusquadricauda)的研究[22]中，添加40 mg/L的聚丙烯酰胺(陽離子)沉降率可達90%，低于本實驗添加6 mg/L聚丙烯酰胺(陽離子)的eh1(99.80%)和eh3(97.11%)沉降率。絮凝劑用量的差異可能來自于藻種的不同和測量計算方法的差異，實驗添加絮凝劑效果與已有研究大致相同。

同時，共培養調節pH也是一種高效的采收方式。微藻在不同條件(自然條件、添加絮凝劑和調節pH)下，eh1和eh3單獨培養26 d及共培養20 d的沉降率見圖2。

注：添加絮凝劑均為最優添加量下的沉降率。

由圖2可見，自然條件下eh1、eh3單獨培養和共培養30 min沉降率分別為10.01%、53.60%和50.78%。無論是單獨培養還是共培養，在實驗過程中并未產生明顯的液面分層，結合沉降實驗現象和數據認為自然條件下各組均不具有明顯的沉降效果。調節pH為7.0后進行沉降實驗，結果顯示單獨培養的eh1、eh3沉降率分別為16.40%和56.70%，無顯著提升，而調節pH至7.0后的共培養體系沉降率可達到95.38%，較調節前的50.78%有顯著提升，且與添加某些絮凝劑的沉降率持平，具有顯著的沉降效果。

微藻在液體培養基中大多處于懸浮狀態，并因其表面所帶負電荷使得微藻細胞之間產生斥力，形成穩定的懸濁液，導致采收困難[16]。在本實驗中，無論是單獨培養，還是共培養均不能得到較好的沉降效果；添加絮凝劑后，無機絮凝劑(氯化鐵和明礬)所帶的陽離子Fe3+和Al3+等與微藻表面的負電荷中和，消除了表面斥力實現了去膠?；?，有機絮凝劑則發揮網捕和架橋作用，將藻體通過包裹或連結的方式聚集到一起結成塊狀，這都促進了微藻的絮凝沉降[22]；共培養后調節pH可以達到與添加絮凝劑相似的微藻細胞沉降效果，共培養使得不同微藻產生的代謝產物在藻體外形成胞外聚合物[23]，這些胞外聚合物通過網捕架橋作用將藻體聚集在一起實現絮凝，這在一定程度上增強了絮凝效果，而調節pH后消除了微藻表面所帶電荷，使得藻體之間的斥力瓦解，進一步促進了藻體間的胞外聚合物將藻體絮凝成團，實現短時間內的快速沉降。

添加絮凝劑能夠實現較好的采收，無機絮凝劑雖然價格較為低廉，但會對環境產生較大污染，需要進行嚴格的處理后才能排放，無形中增加微藻的采收成本；有機絮凝劑(聚丙烯酰胺(陽離子)和殼聚糖等)污染較小，但因其價格較高，一般多用于高附加值產品，所以添加絮凝劑的方法不適用于大規模微藻的采收。而共培養后調節pH的方法，對沉降率提升顯著，與添加絮凝劑的沉降率接近，并且由于將藻液調節pH至中性，對環境造成的污染和破壞小，可以較大程度地降低采收后液體的后處理成本。

3 結 論

在油脂生產方面，共培養條件下的油脂產率較eh1、eh3單獨培養分別提高了1.22倍和1.53倍，增加較顯著；在采收方面，共培養后調節pH至7.0，30 min內沉降率達到95.38%，遠超過單獨培養條件下的沉降率，與添加絮凝劑的沉降率接近。微藻共培養結合調節pH為中性，是一種能有效提高油脂產率并降低采收成本的方法，具有較強實際應用價值。