阿司匹林對人牙齦成纖維細胞增殖及凋亡的影響

邱燕玲 聶敏海 余麗 陳雨荷 劉旭倩

臨床觀察發現同時患有心血管疾病和牙周炎的患者，在服用阿司匹林后牙齦易出血，牙周炎癥狀較重，牙齦指數(GI)、齦溝出血指數(SBI)、探診深度(PD)、附著喪失(AI)、松動度(M)等均較未服用阿司匹林者呈現更嚴重的臨床表現。阿司匹林是臨床常用藥物，廣泛用于心血管疾病、合并心血管疾病的糖尿病，以及結直腸癌一級預防[1]、高危妊娠女性先兆子癇預防[2]等。諸多研究表明，阿司匹林和牙周炎關系密切。Du等[3]研究發現在富含血小板纖維蛋白的環境中，阿司匹林的緩慢釋放可促進牙周韌帶間充質細胞的增殖和遷移。Ding等[4]通過臨床對照研究發現，長期服用小劑量阿司匹林的慢性牙周炎和冠心病患者，在不停藥的情況下，可正常開展牙周病的機械治療，能夠正常止血。Elkhouli[5]通過隨機雙盲法實驗，發現在出現2級分叉的牙周病變患者中，同時服用小劑量阿司匹林者比單純植骨者牙周袋深度減低、臨床附著增加，表明植骨與阿司匹林聯合治療可有效控制牙周炎癥。牙周病治療的目的即是獲得牙周支持組織的再生，人牙成纖維細胞(human gingival fibroblasts，HGFs)作為牙周膜和牙齦最主要的細胞，是牙周支持組織的重要組成部分，是誘導牙周組織再生的基礎細胞，進一步探討阿司匹林對HGFs的影響，將為牙周病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牙齦組織來源 健康青少年牙齦組織取自西南醫科大學附屬口腔醫院頜面外科門診，經患者和/或監護人同意并簽署知情同意書后，切取少量下頜阻生智齒拔除時無炎癥牙齦，患者年齡18～24 歲。

1.1.2 主要試劑和藥品 阿司匹林(Sigma，美國)，實驗前取18.0 mg阿司匹林粉末溶解于0.1 ml二甲基亞砜(Sigma)，加入10 ml完全培養基，配置10 mol/L的阿司匹林培養液，0.22 μmol/L濾膜(Sigma)過濾除菌后4 ℃保存，待配成所需濃度。DMEN低糖培養液(HYCLONE，美國)，含15%胎牛血清(HYCLONE)、2%青鏈霉素(HYCLONE)。MTT試劑盒(Sigma)，CCK-8試劑盒(碧云天)，細胞凋亡檢測試劑盒(凱基)等。

1.1.3 主要儀器 2300型恒溫CO2培養箱、EPICS XL型流式細胞儀(Coulter公司 ，美國)，KDC-1044低速離心機(安徽中科中佳)，自動酶標光度儀(Biotect，美國)，倒置顯微鏡(SHELLAB，美國)等。

1.2 方法

1.2.1 HGFs的分離與培養 取18～24 歲健康青少年阻生智齒拔除時小部分牙齦組織，通過組織塊貼壁法進行原代培養。待細胞長至80%～90%時，常規胰酶消化傳代[6]。

1.2.2 HGFs的鑒定 免疫組化SP法鑒定細胞來源。滴定細胞爬片，10%甲醛固定，分別進行抗Vimentin抗體和抗CK抗體孵育，倒置顯微鏡觀察染色結果。

1.2.3 MTT法檢測增殖 分別取第2至第5代HGFs消化制備成1×105/ml的單細胞懸液，接種于96 孔板，每組設4 個復孔，酶標儀于24、48、72、96 h檢測相應A值，繪制細胞的增殖曲線。

1.2.4 CCK-8檢測阿司匹林促增殖濃度范圍 取處于對數生長期的第3代HGFs，胰酶消化制備成1×105/ml的單細胞懸液，接種于96 孔板，實驗分11 組，9 個實驗組(A-I)，1 個空白對照組(J)，1 個對照組(K)，每組設6 個復孔。A-I組分別加入0.25、0.5、0.8、2、4、6、8、10、12 mol/L阿司匹林培養液各100 μl；J組不加細胞，不加阿司匹林，為空白對照組；K組加檢測細胞，為對照組。邊緣孔填充無菌PBS，5%CO2培養箱培養24 h后換液。分別于24、48、72 h，各加入CCK-8液10 μl，酶標儀檢測A值，繪制不同濃度阿司匹林處理后在不同時間點的A值柱狀圖。

1.2.5 流式細胞儀檢測HGFs的凋亡 實驗分組同上，每組4 個復孔。處理48 h后PBS洗滌，不含EDTA的胰酶消化制備成5×105/ml的單細胞懸液，加入500 μl的Binding Buffer 懸浮細胞，加入5 μl的Annexin V-EGFP混勻后，再加入5 μl的Propidium lodide混勻，室溫、避光反應15 min左右，流式細胞儀檢測[7]。

1.3 統計學方法

使用SPSS 17.0進行統計學分析。多組均數間比較，采用單因素方差分析。P<0.05認為結果具有統計學差異。

2 結 果

2.1 HGFs的分離與培養結果

本實驗收集12 例牙齦組織，均在6 d左右開始有細胞游出，以組織塊為中心成放射狀排列(圖 1A)。分別采集不同代次細胞倒置顯微鏡下圖像，觀察到細胞傳代后貼壁良好，生長速度快，形態穩定，呈梭形或紡錘形，有多個較長突起，包漿豐滿，核呈圓形或卵圓形，有1～3 個核仁。細胞長至底壁80%左右，開始呈現漩渦狀、柵欄狀(圖 1B) 。

圖 1 HGFs原代培養(A)和傳代培養(B) (倒置顯微鏡, A: ×100; B: ×40)

Fig 1 The primary(A) and passage(B) culture of HGFs (Inverted microscope, A: ×100; B: ×40)

2.2 MTT最佳代次選擇結果

圖像近似“S”形，接種24～48 h生長較為緩慢，48～72 h生長最為迅速，72 h后細胞數量趨于穩定，之后緩慢下降。細胞生長曲線呈“滯緩-對數生長-平臺”模式(圖 2)。

2.3 免疫組化鑒定結果

免疫組化結果顯示：細胞Vimentin蛋白染色陽性，胞漿均質黃染(圖 3A)。CK蛋白染色陰性，胞漿不著色(圖 3B)。

圖 2 第2～5代細胞增殖曲線

2.4 不同濃度阿司匹林對HGFs增殖的影響

不同濃度藥物組與對照組A值在24～96 h呈先上升后下降趨勢，在72 h，A值達到最大(圖 4)。低濃度組(0.25、0.5、0.8 mol/L)與對照組相比，A值均高于對照組(P<0.05)；中高濃度組(2、4、6、8、10、12 mol/L)與對照組相比，A值明顯減低(P<0.01)。低濃度組組內、中濃度組組內、高濃度組組內A值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.5 不同濃度阿司匹林作用下HGFs的凋亡情況

隨著阿司匹林濃度增加，細胞凋亡增多。各組內單因素方差比較，差異無統計學意義(P>0.05)，組間差異有統計學意義(P<0.05)(圖 5)。

圖 3 波形絲蛋白(A)和角蛋白(B)在HGFs中的表達 (IHC, A: ×100; B: ×200)

Fig 3 Vimentin(A) and Keratin(B) expression of HGFs (IHC, A: ×100; B: ×200)

圖 4 不同濃度及時間阿司匹林對HGFs增殖的影響

Fig 4 The proliferation of HGFs treated with various concentration of aspirin and for different period

圖 5 不同濃度阿司匹林作用下HGFs的凋亡情況

3 討 論

阿司匹林在最初因鎮痛、退熱作用被廣泛使用，后又發現其具有良好的抗血栓、消炎以及治療心血管疾病、糖尿病，預防高危妊娠女性先兆子癇等作用。長期臨床觀察以及實驗研究，發現阿司匹林不僅通過抗凝途徑對牙周病產生影響，還直接對牙周組織產生影響。Li等[8]研究表明，牙周病的炎性環境導致組蛋白乙酰轉移酶GCN5表達降低，從而降低牙周韌帶干細胞的成骨分化。通過動物實驗，發現注射阿司匹林可上調GCN5、控制牙周炎癥、促進牙周韌帶干細胞成骨分化。而Rahman等[9]研究也發現阿司匹林可調節生長相關基因的表達以及促進牙周韌帶干細胞的成骨分化。也有對照研究表明[10]，氯吡格雷可顯著降低炎性浸潤,促進膠原纖維數量增加，而對照組阿司匹林在牙周炎的使用中不能防止骨質流失。這些研究主要集中在阿司匹林對牙周韌帶干細胞、成骨細胞的影響，而HGFs作為牙周組織最重要的細胞之一，目前國內外少見有報道。HGFs是牙齦結締組織中的主要細胞，具有活躍的自我更新能力，不僅可以合成膠原纖維、彈力纖維，同時也是結締組織基質的重要組成成分，王坤等[11]研究發現HGFs具有一定的潛在成骨能力，有望成為牙周組織工程的種子細胞；牙齦組織較牙周膜來源更為廣泛，取材時創傷較小，取材量更大，且體外培養牙齦成纖維細胞成功率高于牙周膜成纖維細胞；在牙周炎初期，炎癥首先波及牙齦組織，因此建立HGFs模型將有利于對牙周病發病機制的探討及牙周病防治。

本實驗以HGFs為切入點，進行HGFs培養，免疫組化鑒定，MTT最佳代次選擇，通過不同濃度阿司匹林作用后檢測細胞增殖和凋亡，以探討阿司匹林對HGFs是否有影響。

本實驗采用經典的組織塊貼壁法，操作簡便，成功率高。在培養過程中，可見有立方狀上皮細胞首先游出，但HGFs增殖能力明顯強于牙齦上皮細胞，且胰酶消化時，HGFs敏感性強，可首先被消化分離，通過多次傳代消化，HGFs可得到充分純化。免疫組化SP法顯示，細胞抗Vimentin染色陽性，抗CK染色陰性，證明細胞來源于中胚層[12]，結合取材部位，可充分證明細胞是牙齦成纖維細胞。體外細胞實驗需要良好的細胞狀態，本實驗設計MTT最佳代次選擇實驗，繪制細胞生長曲線，結合細胞形態學觀察，顯示第3代HGFs形態穩定，狀態良好，增殖速度快，適用于實驗研究。

本實驗選用第3代HGFs，通過加入不同濃度阿司匹林，檢測細胞的增殖情況。阿司匹林濃度范圍的確定則基于文獻以及前期的預實驗。CCK-8結果顯示：低濃度阿司匹林(≤0.8 mol/L)對HGFs有促進增殖作用，中高濃度(≥2 mol/L)阿司匹林則明顯抑制細胞增殖，且濃度越高，抑制作用越明顯?？紤]原因為：阿司匹林作為一種酸性藥物，PH過低可影響細胞活性，隨著藥物濃度的增加，PH可明顯降低，故對細胞活性影響較大。而在較低濃度，培養基PH變化不大，故對細胞活性影響不大，未能掩蓋阿司匹林本身對細胞的促增殖作用。因此本實驗可進一步改進：調節加藥后培養液PH以減少培養液酸堿性對細胞活性的影響；縮小藥物濃度間隔以找到最佳促增殖濃度以及最低抑制濃度。在凋亡試驗中，實驗分組同增殖實驗。檢測結果仍表明在組內無統計學差異，組間比較有統計學差異。故實驗結果圖分別選用了空白組、0.5 mol/L組、4 mol/L組、10 mol/L組。因實驗分組并未做到更小量化，且未對培養液進行PH調節，故最低促凋亡濃度需要進一步探討。