脂質組成對人膠質瘤細胞系惡性程度的影響

齊 飚， 楊 晨， 吳 劍， 王紅章， 高 竑， 李秋平,2*

1. 復旦大學附屬中山醫院廈門醫院神經外科，廈門 361015 2. 復旦大學附屬中山醫院神經外科，上海 200032

神經膠質瘤是最常見的原發性顱內惡性腫瘤，約占成人原發性顱腦腫瘤的40%～50%。神經膠質瘤具有浸潤性生長、易復發等特點，患者治愈率低、預后差、總體生存期短[1-2]。臨床上對于神經膠質瘤惡性程度的判斷主要依靠世界衛生組織(WHO)的分類系統，膠質瘤被分成4級：Ⅰ級以毛細胞型星形細胞瘤為代表，Ⅱ級以少突膠質細胞瘤為代表，Ⅲ級以間變型膠質細胞瘤為代表，Ⅳ級則為多形性膠質母細胞瘤(GBM)[3-4]。惡性膠質瘤通常指GBM，占神經膠質瘤總數的60%～70%，目前以手術為主、放化療為輔的綜合治療療效欠佳，GBM患者的中位生存期僅為首次診斷后的12～15個月，是目前最難治療的癌癥之一[5]。

脂質組學(lipidomics)著眼于全面系統地分析生命體脂質組成，尋找疾病相關的脂質標志物，預測脂質與生物化合物相互作用過程中的改變，進而研究脂質代謝網絡和動態調控在各種生命現象中的作用規律[6]。完整的脂質組學流程包括脂質提取、脂質組鑒定和定量分析、統計學分析和數據解釋，其中靈敏、可靠的脂質組分析方法是研究的難點和關鍵[7]。本研究擬建立并優化Shotgun脂質組學策略，對膠質瘤細胞系A172、U251和U87MG進行規模性、整體性的脂質組成鑒定，結合多變量統計分析手段，尋找與膠質瘤惡性分化演變相關的脂質變化和代謝調控網絡。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 人膠質瘤細胞系：3種成瘤能力不同的人膠質瘤細胞系，A172在裸鼠體內無法成瘤；U251具有裸鼠皮下成瘤能力；U87MG是高侵襲性膠質瘤細胞系，在裸鼠皮下成瘤最快[8]。主要試劑：色譜級甲醇、氯仿、異丙醇、正己烷購自Merck Millipore(USA)，色譜級甲酸、乙酸銨購自ThermoFisher(USA)，脂質內標購自Avanti Polar Lipids(USA)，磷酸、氯化鉀購自國藥集團(中國)。

2 結 果

表1 Shotgun脂質組學ESI-MS掃描方法

PC：phosphatidylcholine，磷脂酰膽堿；PE：phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺；PG：phosphatidylglycerol，磷脂酰甘油；PS：phosphatidylserine，磷脂酰絲氨酸；PA：phosphatidic acid，磷脂酸；PI：phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇；SL：sulfatide，硫脂；SP：sphingolipids，鞘脂；SM：sphingomyelin，鞘磷脂

圖1 Shotgun脂質組學技術分析3種人膠質瘤細胞系的主要脂質組成

2.2 定量比較人膠質瘤細胞系脂質種類和脂肪酸側鏈分布 通過對3個膠質瘤細胞系在正負離子掃描模式下EMS圖譜進行比對，發現膠質瘤細胞系的脂質組成相似。為了獲悉脂質組成與膠質瘤細胞系轉移潛能的相關性，本研究對主要的脂質種類和脂肪酸側鏈分布進行了相對定量分析。與無成瘤能力的A172細胞系相比，大多數甘油磷脂的種類(如PC、PA和PG)在惡性膠質母細胞瘤細胞U251和U87MG中呈現表達上調的趨勢，其中PC和PA的表達升高有顯著的統計學差異(P<0.05)；含d18∶1的鞘脂(d18∶1 SP)則隨著膠質瘤成瘤能力和轉移潛能的增加表達呈顯著降低(P<0.05，圖2A)。在ESI正離子掃描模式下，三酰甘油(TG)在U251和U87MG中表達上調近1.5倍(P<0.05，圖2B)。

圖2 人膠質瘤細胞系中主要脂質種類的相對質譜強度

通過對串級質譜PI和NL掃描的數據進行定量分析，獲悉脂肪酸側鏈在膠質瘤細胞系中的總體分布情況。C16、C18和C20系列的脂肪酸鏈是細胞系脂質組成主要的酰基側鏈類型。與A172相比，C15∶0的表達在惡性膠質母細胞瘤細胞U251和U87MG中發生顯著性下調；C20∶1和C20∶4的表達發生顯著性上調(P<0.05)。C18∶1的表達在U251和U87MG細胞系中呈現下調趨勢，C18∶3的表達則隨著膠質瘤細胞系轉移潛能的增加而上調，但組間差異不存在統計學意義。此外，與U251相比，C16∶0的表達在具有高轉移潛能U87MG中發生顯著性下調，C16∶0表達則下調約2.52倍(P<0.05，圖3)。

圖3 人膠質瘤細胞系中脂肪酸鏈分布的相對質譜強度

2.3 分層聚類分析人膠質瘤細胞系脂質變化 對3個人膠質瘤細胞系中鑒定到的所有脂質進行相對定量分析，設置卡值標準為不同組間脂質分子質譜信號強度倍數變化>1.5或<0.67且P<0.05，篩選到121個差異具有統計學意義變化的脂質分子。差異脂質分子信號強度歸一化前后數據分布如圖4A所示。A172、U251和U87MG的變量組間差異采用單因素方差分析檢驗(ANOVA)來排序，分層聚類分析(HCA)如圖4B中熱圖所示，Pearson相關性用于組間距離測量，每行代表1個差異表達的脂質分子，每列代表1個細胞樣品，每組樣品含3次生物學重復；不同色塊提示從2～-2不同的組間相關值，橙色為正相關，藍色為負相關，灰色提示缺失值。121個差異脂質分子的相對強度揭示數據分為兩簇，一簇僅含A172細胞系，另一簇則包含U87MG、U251。

圖4 分層聚類分析不同人膠質瘤細胞系中的差異脂質分子

2.4 多變量統計分析人膠質瘤細胞系脂質變化 主成分分析(PCA)用于對不同細胞系間的脂質變化做多變量統計學分析。在PCA分析中(圖5A)，第一主成分(PC1)的方差貢獻可占總方差的47.9%，并且將無成瘤能力的A172與具有成瘤和轉移潛能的U251和U87MG細胞區分開來；第二主成分(PC2)的方差貢獻占25.6%。變量投影重要性(VIP)準則用于差異脂質分子在解釋不成瘤和成瘤膠質瘤細胞分離效果時作用的重要性，認為VIP值大于1的差異脂質分子在解釋分離效果時即有重要的作用。VIP值打分最高的15個差異脂質分子見圖5B，其中PC 18∶1/18∶1的VIP值高達1.63，在解釋分離效果時有最重要的作用。不同的統計分析方法均表明差異脂質組成能將具有成瘤和轉移能力的細胞系U251和U87MG與無成瘤能力的細胞系A172系區分開來。

圖5 多變量統計學分析用于系統性分析不同人膠質瘤細胞系中的差異脂質分子

3 討 論

脂質是三大營養物質之一，是生物膜的重要成分，是生物體儲能的主要場所。脂質也是重要的信號分子，多種脂質分子及其代謝中間產物參與血管炎癥、細胞增殖、細胞黏附和運動等生理和病理過程[14]。脂質是目前在化學結構上最多樣化的生物有機分子，脂肪酸的長度、飽和度、雙鍵位置以及順反異構均影響脂質分子的空間結構，從而影響細胞膜的功能和膜蛋白的活性[15]。基于質譜分析的脂質組學技術靈敏度高，分辨率好，能進行高通量檢測，并能獲取脂質分子的結構信息。

脂質代謝發生改變是腫瘤細胞的重要特征之一，其與腫瘤的發生發展互為因果關系[16-17]。近年研究提示，具有生物活性的特征性脂質分子和脂質代謝通路的激活與多種實體腫瘤的進程緊密相關。Yue等[18]在晚期和轉移性前列腺癌組織單細胞水平的脂滴中發現異常積累的酯化膽固醇，這導致抑癌基因PTEN失活和促進腫瘤生長的代謝途徑激活。Guri等[19]發現蛋白mTORC2能夠刺激肝臟腫瘤中神經酰胺和心磷脂的產生，從而滿足癌細胞對營養代謝和能量的需求。此外，結構多樣的脂質能與蛋白質發生相互作用。鑒于每種細胞類型中含有數千種不同結構的脂質分子，生命體很可能存在大量的蛋白質-脂質相互作用，構成復雜的代謝調控網絡[20]。綜上，代謝物能驅動異常的基因調控，代謝重編程對基因表達、細胞增殖與腫瘤微環境影響深遠。

腫瘤細胞的高侵襲性與頻繁復發相關，細胞系在裸鼠體內的成瘤能力在一定程度上反映了惡性潛能。雖然A172、U251和U87MG來源于不同的患者，但不同的生長模式和體內成瘤能力使其成為研究膠質瘤發生發展的有價值的細胞模型。脂質分子在腫瘤生長中極為重要，并且可能與膠質瘤復發轉移有關。脂質表達譜的比較研究可以揭示差異功能脂質并提供有用的信息。由于分辨率高、快速靈敏、重現性好以及高通量等優點，Shotgun技術常用于系統研究生命體的整體脂質組成及其復雜的代謝網絡[21]。本研究通過Shotgun脂質組學分析，共鑒定到1 541種脂質分子，篩選到121個具有統計學差異變化的脂質分子，并通過多元變量統計分析揭示差異脂質組成能將具有成瘤和轉移能力的細胞系U251和U87MG與無成瘤能力的細胞系A172系區分開來。這些差異表達的脂質可能與神經膠質瘤轉移復發有關。這些發現可能有助于開發新的診斷標志物和膠質瘤的治療靶點。

目前報道的神經膠質瘤相關的脂質組學研究，主要將神經膠質瘤細胞系或臨床血清/血漿樣本作為研究對象[22-23]。科學界尚未系統繪制與神經膠質瘤各組織學分級密切相關的脂質組成圖譜，特別是針對組織學分級為Ⅳ級的惡性膠質母細胞瘤臨床標本的脂質組學研究尚未見報道。我們正在積極收集神經膠質瘤組織標本，通過對神經膠質瘤組織標本進行大規模脂質定性定量研究，挖掘神經膠質瘤是否有特定的脂質代謝特征；篩選不同組織學分級的癌組織中顯著變化的脂質分子，以確定差異功能脂質在人類膠質瘤進程中的特異性和預后價值。綜上，我們試圖在不久的將來，實現在脂質層面上對神經膠質瘤轉移復發進行預測，并結合隨訪資料探討脂質組成差異對神經膠質瘤發生、發展以及預后的影響。