阻斷PI3K/AKT/mTOR通路增強順鉑誘導的人皮膚黑素瘤細胞株A375凋亡的機制研究

張斌斌 王湘琦 趙超然 熊愛兵

[摘要]目的：本實驗探討抑制PI3K/AKT/mTOR通路對順鉑誘導人皮膚黑素瘤細胞株A375細胞凋亡作用及其機制。方法：用順鉑處理人皮膚黑素瘤細胞株A375細胞后Western blot檢測細胞凋亡、PI3K/AKT/mTOR通路的活化情況以及細胞增殖-毒性檢測試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）。用PI3K的抑制劑LY294002（LY）和mTOR的抑制劑雷帕霉素（Rapamycin，Rap）分別預處理以研究其對順鉑處理后人皮膚黑素瘤細胞株A375細胞凋亡的協同作用。為進一步探索阻斷PI3K/AKT/mTOR通路對順鉑處理后人皮膚黑素瘤細胞株A375細胞凋亡的協同作用機制，采用Western blot檢測阻斷PI3K/AKT/mTOR后聯用順鉑處理人皮膚黑素瘤細胞株A375細胞中Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達。結果：順鉑處理后的A375黑素瘤細胞中PARP的活化剪切體表達量水平呈濃度和時間依賴性增加，細胞活力呈濃度和時間依賴性降低（P<0.05）。順鉑處理A375黑素瘤細胞后PI3K/AKT/mTOR通路的活化。阻斷PI3K/AKT/mTOR通路再用順鉑聯合處理A375黑素瘤細胞后PARP的活化剪切體表達量明顯上調以及細胞活力明顯降低（P<0.05）。阻斷PI3K/AKT/mTOR通路后再用順鉑聯合處理A375黑素瘤細胞發現Bcl-2蛋白和Bcl-xl表達水平下調。結論：阻斷PI3K/AKT/mTOR通路對順鉑誘導的細胞凋亡具有協同作用，該協同作用可能與Bcl-2和Bcl-xl蛋白下調有關。

[關鍵詞]PI3K/AKT/mTOR;Bcl-2;黑素瘤細胞;A375;順鉑;凋亡

[中圖分類號]R732.2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）08-0072-05

黑素瘤（melanoma）是起源于黑素細胞的惡性腫瘤，常發生在皮膚、黏膜等。近年來，黑素瘤的發病率和死亡率正在逐步增加[1-4]。它的發生、發展與紫外線照射時間延長、女性激素、砷化物、酒精、輻射和飽和脂肪等有關[5-6]。目前對于黑素瘤的治療方案有手術治療、藥物治療和分子靶向治療。盡管手術切除治療黑素瘤是一種有效的手段，但是術后往往容易導致腫瘤的復發、患者生存率不盡人意[7-8]。此外，近年來對于黑素瘤的藥物化療研究逐漸增多，但是由于其腫瘤產生的耐藥性、藥物化療效果并不理想，所以有必要探討新的治療策略。有研究報道顯示，藥物化療與分子靶向治療在抗腫瘤中具有很好的抑制作用[9-10]。因此，本文探討藥物與分子靶向在黑素瘤中的作用及機制。

順鉑（cisplatin）是中心以二價鉑同兩個氯原子和兩個氨分子結合的重金屬絡合物，類似于雙功能烷化劑，可抑制DNA的復制過程，也是腫瘤治療中的常用化療藥物，其誘導肝癌、肺癌和卵巢癌等各種腫瘤細胞凋亡[11-12]。但是，順鉑誘導人皮膚黑素瘤細胞凋亡及凋亡耐受的具體機制卻少有人報道。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）是近年來研究較為廣泛的信號通路之一，該通路可抑制多種毒性刺激誘導的細胞死亡，其作用在各類腫瘤細胞都有所體現[13-17]。因此，探討黑素瘤細胞耐受順鉑的機制是否與PI3K/AKT/mTOR通路有關具有重要意義。

本實驗通過Western blotting、CCK-8等方法分析順鉑對A375黑素瘤細胞的影響，阻斷PI3K/AKT/mTOR通路后再用順鉑對A375黑素瘤細胞的凋亡和細胞活力影響及阻斷PI3K/AKT/mTOR通路增強順鉑對A375黑素瘤細胞凋亡的機制進行研究。

1? 材料和方法

1.1 藥品與抗體：PI3K抑制劑（LY294002，LY）、mTOR抑制劑Rapamycin（Rap）購自美國Santa Cruz公司，順鉑（Cisplatin）購自美國Selleck Chemicals公司。抗PARP（PARP，poly ADP-ribose polymerase）、p-AKT（Ser473） 、AKT、p-P70S6K、P70S6K、Bcl-2、Bcl-xl一抗購自美國Cell Signaling Technology公司，GAPDH一抗購自美國Santa Cruz公司，CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。人皮膚黑素瘤細胞株A375購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 細胞培養：人皮膚黑素瘤細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養基培養于5% CO2，37℃孵箱。視細胞生長情況換液，待細胞生長達到對數生長期時進行實驗研究。

1.3 Western blot分析：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠（ SDS-PAGE）電泳分離蛋白質，采用hoefer半干電轉移將蛋白分子轉移到PVDF膜上，轉膜后將PVDF膜加入5%牛血清白蛋白進行封閉，室溫輕搖封閉1h。待封閉結束后，1×TBST洗滌3次（5min/次）后，PVDF膜與一抗稀釋液室溫下輕搖動孵育30min，4℃冰箱過夜，回收一抗，1×TBST洗滌3次（5min/次）。PVDF膜與熒光二抗稀釋液于室溫下輕搖動孵育1h，回收二抗，1×TBST洗滌3次（5min/次） 。Odyssey-CLX掃描顯影。

1.4 蛋白提取：采用不同濃度順鉑（0、5、10、20mg/ml）刺激A375黑素瘤細胞24h后提取蛋白;采用順鉑（10mg/ml）處理A375黑素瘤細胞12h、24h、36h，分別提取每個時間點的蛋白;LY294002（PI3K通路抑制劑）預處理黑素瘤細胞A375中1h后聯用順鉑（10mg/ml）處理12h，24h，提取蛋白;Rap（mTOR通路抑制劑）預處理黑素瘤細胞A375中1h后聯用順鉑（10mg/ml）處理12h，24h，提取蛋白;依據以上實驗分組情況，待藥物處理達到預定時間后，棄掉六孔板中培養液，PBS沖洗3次，隨即向各孔中加入適量含蛋白酶抑制劑的IP裂解液（約100μl），輕微晃動，使IP裂解液覆蓋所有細胞，將六孔板置于冰上約15min。用細胞刮將細胞刮下并用1.5ml EP管收集，用超聲波細胞粉碎冰上超聲破碎細胞，超聲3次（5s/次）。用4℃低溫離心機12 000rpm離心15min，取離心后上清液裝入新的1.5ml EP管中，置于冰上。樣品變性：根據EP管中取得的蛋白樣品總體積，加入1/5總體積的5×蛋白loading buffer，充分混勻后，在100℃蜂窩爐煮變性5～10min，最后放在冰上約3min。

1.5 細胞活力檢測（CCK-8）：①根據實驗設計將不同濃度順鉑（0、5、10、20mg/ml）刺激A375黑素瘤細胞24h后，取出培養板;②倒掉培養基，向待檢測孔中加20?l的CCK-8溶液;③將CCK-8溶液處理后的培養板，直接放入37℃孵箱繼續培養2h;④采用多功能微孔板檢測儀測定每孔490nm處的吸光度，得到每孔的OD值;⑤測得的每個孔中OD值，制作時間點-活細胞率曲線圖。實驗重復至少3次。

采用CCK-8分別檢測：順鉑（10mg/ml）處理A375黑素瘤細胞0h、24h、48h、72h的OD值;LY294002（PI3K通路抑制劑）預處理黑素瘤細胞A375中1h后聯用順鉑（10mg/ml）處理0h、24h、48h、72h的OD值;Rap（mTOR通路抑制劑）預處理黑素瘤細胞A375中1h后聯用順鉑（10mg/ml）處理0h、24h、48h、72h的OD值;根據測得的OD值制作時間點-活細胞率曲線圖。

1.6 統計學分析：所有結果均采用SPSS 23.0軟件進行統計分析。

2? 結果

2.1 順鉑誘導黑素瘤A375細胞凋亡具有濃度和時間依賴性：為研究黑素瘤A375細胞在不同濃度順鉑（0、5、10、20mg/ml）刺激24h下的凋亡情況，筆者采用Western blot檢測不同濃度順鉑（0、5、10、20mg/ml）刺激下黑素瘤A375細胞PARP的活化剪切體表達，發現隨著順鉑濃度的增加，剪切的PARP表達增加，這說明細胞凋亡增加（圖1A）。與此同時，用順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞12h、24h、36h，結果顯示隨著時間的推移，PARP的活化剪切體表達水平增加，說明順鉑誘導的細胞凋亡隨著時間的推移而增加（圖1B）。 此外，為了進一步驗證順鉑對黑素瘤A375具有抑制作用，采用CCK-8試劑盒檢測不同濃度順鉑（0、5、10、20mg/ml）處理黑素瘤24h后的細胞活性影響，發現隨著濃度的增加，細胞活性減弱，這提示細胞凋亡（圖1C）。同時采用順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞0h、24h、48h、72h，結果提示隨著時間的推移，細胞活力也減弱（圖1D）。這些進一步論證順鉑誘導的細胞凋亡隨著時間的推移而增加。

2.2 順鉑誘導黑素瘤A375細胞PI3K/AKT/mTOR通路的活化：為研究順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞在不同時間點（12h、24h）后的PI3K/AKT/mTOR通路的影響，筆者通過Western blot檢測黑素瘤A375細胞在順鉑（10mg/ml）處理12h、24h后，p-AKT（S473） 、p-P70S6K均表達上調。說明順鉑誘導PI3K/AKT/mTOR通路的活化，見圖2。

2.3 抑制PI3K/AKT/mTOR通路增強順鉑在黑素瘤A375細胞中誘導的細胞凋亡：為了研究PI3K/AKT/mTOR通路在順鉑誘導黑素瘤A375細胞的細胞凋亡中的作用，采用PI3K抑制劑LY294002預處理1h阻斷PI3K/AKT通路后再用順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞24h，36h，Western blot結果顯示，預處理后聯用順鉑組與順鉑組相比，PARP蛋白的活化剪切表達量明顯上調，說明阻斷PI3K/AKT增強順鉑誘導的細胞死亡。（圖3）。與此同時，用mTOR的抑制劑Rap預處理1h阻斷mTOR通路后再用順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞24h，36h，Western blot結果顯示，預處理后聯用順鉑組與順鉑組相比PARP蛋白的活化剪切表達量明顯上調。

此外，為了進一步驗證PI3K/AKT/mTOR通路在順鉑誘導黑素瘤A375細胞的細胞凋亡中的作用，采用PI3K抑制劑LY294002預處理1h阻斷PI3K/AKT通路后再用順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞0h、24h，48h、72h，CCK-8結果顯示預處理后聯用順鉑組與順鉑組相比，細胞的活力明顯減弱（圖3A）。與此同時，用mTOR的抑制劑Rap預處理1h阻斷mTOR通路后再用順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞0h、24h，48h、72h，CCK-8結果顯示預處理后聯用順鉑組與順鉑組相比，細胞的活力明顯減弱（圖3B）。總之，抑制PI3K/AKT/mTOR通路增強順鉑在黑素瘤A375細胞中誘導的細胞凋亡。

2.4 抑制PI3K/AKT/mTOR通路增強了順鉑在黑素瘤A375細胞凋亡，可能與Bcl-2、Bcl-xl表達水平下調有關;為了研究抑制PI3K/AKT/mTOR通路增強了順鉑在黑素瘤A375細胞凋亡的可能機制，筆者在黑素瘤A375細胞中先用LY294002和Rap分別預處理1h分別阻斷PI3K/AKT和mTOR通路后，再用順鉑處理24h，36h，Western blot檢測Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達。結果顯示，LY294002/Rap預處理聯用順鉑組與單用順鉑組相比，Bcl-2和Bcl-xl表達量明顯下調，說明阻斷PI3K/AKT/mTOR通路可能通過下調Bcl-2和Bcl-xl蛋白增強的順鉑誘導的凋亡，見圖4。

3? 討論

黑素瘤是好發于皮膚的惡性腫瘤，目前的治療方案有手術治療、放化療、免疫治療、分子靶向治療等[18-19]。對于藥物化療治療黑素瘤往往缺乏有效的藥物靶點，且對靶向藥物的耐藥性限制了黑素瘤患者長期治療的療效[20]。盡管有報道一些藥物在一定程度上改善了黑素瘤的治療效果，但是黑素瘤對藥物的敏感性下降往往是化療藥物耐藥的關鍵原因之一，其與PI3K/AKT/mTOR作用于黑素瘤細胞息息相關[21-24]。本研究證實順鉑在A375黑素瘤細胞中誘導細胞凋亡，實驗在不同濃度順鉑處理下PARP的活化剪切表達隨著濃度的增加而增加，剪切的parp還隨時間推移而增加;此外，CCK-8細胞活力檢測分析表明隨著順鉑濃度增加和時間的推移A375黑素瘤細胞活力減弱（P<0.05）。這說明順鉑在A375黑素瘤細胞中誘導細胞凋亡。這與他人報道的順鉑在多種癌細胞中的細胞毒性作用結論一致[25-26]。本實驗也證實了阻斷PI3K/AKT/mTOR通路對順鉑誘導的A375細胞具有協同作用，本實驗采用PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑與順鉑聯合處理A375細胞，與單獨使用順鉑組相比，剪切的PARP蛋白表達量明顯上調，CCK-8實驗檢測分析細胞活力減弱（P<0.05），這說明阻斷PI3K/AKT/mTOR通路增強順鉑誘導A375細胞凋亡[27]。為了進一步探索該協同作用的機制，采用PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑與順鉑聯合處理A375細胞后檢測Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達，發現Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達明顯下調。因此推測阻斷PI3K/AKT/mTOR通路對順鉑誘導細胞凋亡中的協同作用可能與Bcl-2和Bcl-xl下調有關。

本研究揭示了阻斷PI3K/AKT/mTOR對順鉑誘導的細胞凋亡具有協同作用，這種保護作用可能與Bcl-2和Bcl-xl蛋白下調有關。

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[收稿日期]2019-01-03

本文引用格式：張斌斌，王湘琦，趙超然，等.阻斷PI3K/AKT/mTOR通路增強順鉑誘導的人皮膚黑素瘤細胞株A375凋亡的機制研究[J].中國美容醫學，2019，28（8）：72-76.