二氧化鈦納米管負載蒲公英多糖對牙齦卟啉單胞菌活性的影響

羅琴琪 李瀟

[摘要]目的：通過陽極氧化二氧化鈦納米管負載不同濃度的蒲公英多糖，研究該復合涂層對牙齦卟啉單胞菌活性的影響，評價其抗菌性能。方法：設置陽極二氧化鈦片為對照組（A組），陽極二氧化鈦片負載不同濃度的蒲公英多糖為實驗組：多糖濃度50mg/ml（B組），100mg/ml（C組），200mg/ml（D組）。場發射掃描電鏡（FESEM）觀察鈦片表面形貌結構，X射線光電子能譜儀（XPS）檢測鈦片表面元素組成，臺盼藍染色熒光顯微鏡下計數活菌/死菌比例數。結果：FESEM下觀察到各組鈦片表面管徑均一的納米管陣列，管徑80～100nm，實驗組納米管表面可見白色粟粒狀顆粒沉積，D組>C組>B組;XPS顯示C含量顯著增加，特征性C峰值增高，D組>C組>B組;臺盼藍染色鏡下觀察牙齦卟啉單胞菌活菌呈現透明，死菌被染成藍色，單視野下死菌數量D組>C組>B組>A組，細菌活性（活菌/死菌×100%）D組

[關鍵詞]二氧化鈦納米管;蒲公英多糖;牙齦卟啉單胞菌;抗菌效應

[中圖分類號]R781.4+2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）08-0109-03

牙科種植修復已經成為牙列缺損或牙列缺失的一種常規治療手段，純鈦及其合金作為種植體材料具有良好的生物相容性。隨著口腔種植研究的不斷發展，簡化治療流程，縮短治療時間，提高種植手術的遠期成功率是目前最為關注的問題。其根本解決辦法是對種植體表面進行生化改性，以期加快形成種植體骨結合，早期功能負載，有效降低術后種植體周圍炎的發生率。

隨著現代納米技術的發展，構建微納米仿生表面形貌已逐步應用到鈦種植體表面的處理。陽極氧化技術（anodizing technology）是一種比較成熟的金屬表面改性方法，能在金屬表面形成納米級管狀結構的氧化涂層。采用陽極氧化法制備的二氧化鈦納米管陣列比表面積大、吸附能力強、生物相容性好，具有一定的抑菌性能，可作為載體進行藥物傳送和加載生物活性因子[1-3]。蒲公英多糖（dandelion polysaccharide）是蒲公英植物的提取物之一，也是蒲公英的主要活性成分之一，蒲公英多糖具有抗菌、抗氧化、抗突變、抗疲勞、增強免疫、調節激素等多種藥理作用[4]，尤以抗菌效應最為突出。孫繼梅等[5]采用微量肉湯稀釋法對臨床常見的203株分離菌進行體外最小抑菌濃度測定，結果提示蒲公英對臨床常見的革蘭氏陽性、陰性球菌均有較好抑菌活性。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）是牙周組織感染中最重要的致病菌，目前公認菌斑聚集是導致種植體周圍炎的始動因子，尤以牙齦卟啉單胞菌多見。潘在興等[6]通過對種植體植入患者的齦溝菌斑標本進行檢測，研究發現牙齦卟啉單胞菌可能是影響種植體周圍骨重建，導致邊緣骨吸收的原因之一。

本研究擬采用陽極氧化技術制備二氧化鈦納米管，通過簡單的物理吸附法負載不同濃度的蒲公英多糖，體外與牙齦卟啉單胞菌共培養，探索該復合涂層的抗菌性能，以期為鈦種植體表面生化改性提供一定的依據。

1? ?材料和方法

1.1 主要實驗材料及設備：純鈦片（99.99%，陜西寶雞鵬潤新金屬材料有限公司）、蒲公英多糖（95%，陜西慈緣生物技術有限公司）、牙齦卟啉單胞菌（廣東省微生物研究所）、臺盼藍（北京雷根生物技術有限公司）、BHI血瓊脂平板（廣東環凱微生物科技有限公司）、直流恒壓電源（DPM8600，杭州鈞策器械股份有限公司）、厭氧工作站（上海萬銳實驗室設備有限公司）、場發射掃描電鏡（Merlin，德國）、X射線光電子能譜儀（THERMO FISHER SCIENTIFIC，美國）、倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本）

1.2 實驗方法

1.2.1 二氧化鈦納米管的制備：商業圓形純鈦片（10mm×

10mm×1mm）依次經800#、1000#、1200#鷹派砂紙打磨，丙酮、乙醇、去離子水超聲清洗，每次15min，空氣中干燥備用。在玻璃燒杯中配制300ml電解液（乙二醇97vol%、氟化銨0.5wt%、水3vol%）。連接直流恒壓電源，將鈦片置于陽極，鉑片置于陰極，設置氧化電壓20V，氧化時間2h。氧化完成后鈦片置于450℃高溫馬弗爐中燒結3h，乙醇、去離子水超聲清洗，每次5min，鈦片清洗完成后置于烘烤箱中干燥備用。

1.2.2 蒲公英多糖的負載與實驗分組：稱取一定量的蒲公英多糖粉末溶于無水乙醇/DMSO （DMSO<1vol%），分別配制濃度為50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml的蒲公英多糖溶液。將陽極氧化處理的鈦片分別置于三種不同濃度的多糖溶液，超聲振蕩處理30min。去離子水漂洗鈦片，去除表面未負載的多糖，空氣中干燥備用。設置陽極氧化鈦片為對照組（A組），陽極氧化鈦片負載不同濃度的蒲公英多糖為實驗組：多糖濃度50mg/ml（B組），100mg/ml（C組），200mg/ml（D組）。

1.2.3 實驗鈦片表征測試：場發射掃描電鏡觀察試件表面形貌;X射線光電子能譜分析檢測試件表面元素組成。

1.2.4 牙齦卟啉單胞菌（Pg）的厭氧培養：自液氮罐內取出凍存的牙齦卟啉單胞菌，復蘇于BHI血瓊脂平板（30%牛腦心浸出液、10%瓊脂、10%氯化血紅素+維生素K1溶液、10%脫纖維羊血），置于37℃厭氧工作站（80% N2、10% CO2、10% H2）培養4～5d。將BHI血瓊脂平板上生長狀態良好的細菌（表面光滑的黑色球形菌落）接種于BHI液體培養基，厭氧工作站中培養2d擴增菌種。用細菌濁度儀配制密度1×106CFU/ml的菌懸液，分別吸取500?l菌懸液接種于孔板內鈦片上，“+”字搖勻后放入工作站中厭氧培養48h。

1.2.5 牙齦卟啉單胞菌（Pg）活性檢測：取出孔板，棄上清液，PBS漂洗兩遍，用細胞刮分別從鈦片上刮取細菌至EP管，加入新鮮PBS重懸細菌。分別吸取180?l菌懸液至12孔板，加入0.4%的臺盼藍染液20?l，“+”字搖勻。熒光顯微鏡下觀察細菌染色情況，計算活/死菌比例。

1.3 統計學分析：采用SPSS 13.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x?±s）的形式呈現，采用單因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）和SNK-q檢驗;計數資料以百分率（%）的形式呈現，采用多個樣本率比較的卡方檢驗（χ2）。假設檢驗采用雙側檢驗，檢驗水準ɑ=0.05，P<0.05時差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 試件表面形貌：FESEM結果：對照A組鈦片表面可見管徑均勻的納米管陣列，納米管管壁光滑，直徑約80～100nm（圖1a）。實驗組（B、C、D組）鈦片表面可見納米管表面及管內有白色粟粒狀顆粒物沉積（圖1b、圖1c、圖1d）。圖中可以看出顆粒物的量與負載蒲公英多糖的濃度呈正相關，D組>C組>B組。

2.2 試件表面元素分析：XPS檢測結果：實驗組（B、C、D組）和對照組（A組）鈦片表面均含有C、N、O元素，實驗組特征性C元素峰值顯著增高，且與負載蒲公英多糖的濃度呈正相關，D組>C組>B組。

2.3 牙齦卟啉單胞菌（Pg）臺盼藍染色：臺盼藍染色結果：熒光顯微鏡下觀察活菌呈現透明，死菌被染成藍色。實驗組（B、C、D組）鈦片表面死菌數量顯著高于對照組（A組），各實驗組間鈦片表面死菌數量與負載蒲公英多糖的濃度呈正相關，D組>C組>B組。

2.4 牙齦卟啉單胞菌（Pg）活性：根據公式：細菌活性（活細菌率%）=活細菌總數/（活細菌總數+死細菌總數）×100%，計算四組鈦片表面細菌活性，得出細菌活性D組

3? 討論

3.1 二氧化鈦納米管負載蒲公英多糖復合涂層的制備：隨著現代納米技術的發展，材料表面納米化改性已成為增加鈦種植體表面粗糙度的一種優良方法。有學陣列者研究表明，采用乙二醇-氟化銨水溶液為電解液，陽極氧化電壓為20V，氧化時間為2h的條件下，可制備出高度有序的TNTs[7-8]。本實驗采用相同的氧化參數成功在鈦片表面制備出二氧化鈦納米管，場發射掃描電鏡下觀察納米管結構規整，直徑約80～100nm，管壁光滑，實驗結果與以往研究相一致。

本研究采用簡單的物理吸附法加載蒲公英多糖在鈦片表面納米管上，與其他生化改性方法相比，該負載方式保證了材料及活性分子的化學結構和生物性能。對于多糖的微觀檢測，本研究在掃描電鏡下觀察到實驗組鈦片納米管表面及內部有粟粒狀顆粒物沉積，沉積量與多糖濃度成正相關;XPS檢測到實驗組鈦片表面特征性C元素峰值顯著增高，且峰值與多糖濃度成正相關。兩種檢測方法直接定性證實蒲公英多糖的成功負載，為該實驗方案的后續實施奠定了基礎。本研究未對多糖負載作定量測定，故未能得到負載量與多糖濃度關系的精確數據支持，這也是本研究有待進一步完善的地方。

3.2 二氧化鈦納米管負載蒲公英多糖復合涂層的抗菌性：目前公認菌斑聚集是導致種植體周圍炎的始動因子，聚集在種植體周圍的菌斑主要為革蘭氏陰性厭氧菌，尤其是牙齦卟啉單胞菌[9-10]。為了研究蒲公英多糖改性的納米管的抗菌性，本研究選定了牙齦卟啉單胞菌為研究對象。實驗采用臺盼藍染色法檢測牙齦卟啉單胞菌活性，正常活菌胞膜結構完整，排斥臺盼藍染液進入菌體，當細菌活性喪失，胞膜通透性增加，因而被染成藍色。本實驗結果顯示，染色后顯微鏡下觀察到實驗組鈦片表面死菌數量顯著高于對照組（P<0.05），實驗組中負載高濃度多糖的納米管表面死菌數量高于負載中濃度多糖的納米管（P>0.05）和負載低濃度多糖的納米管（P<0.05），可以得出二氧化鈦納米管負載蒲公英多糖復合涂層對牙齦卟啉單胞菌具有較強的抗菌性，在一定范圍內，抗菌活性與蒲公英多糖濃度成正相關關系。關于蒲公英多糖的抗菌機制，有研究表明，蒲公英多糖可抑制細菌細胞壁的合成，促使細胞壁破裂，還能抑制DNA和蛋白質的合成[11-12]。有關蒲公英多糖抑制牙齦卟啉單胞菌活性的具體作用機制尚不清楚，有待后續實驗進一步研究。

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[收稿日期]2019-02-12

本文引用格式：羅琴琪，李瀟.二氧化鈦納米管負載蒲公英多糖對牙齦卟啉單胞菌活性的影響[J].中國美容醫學，2019，28（8）：109-112.