HIV感染者外周血PD-1、TIGIT基因表達水平與T細胞分化、凋亡分子分泌的相關性

歐仕穎，余長芳，余海霞，澤汪格瑪，楊建蓉

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染能夠引起獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，主要表現為CD4+T細胞功能缺陷[1-2]，嚴重威脅人類健康，但具體發病機制未明。免疫細胞表面的免疫調控受體在免疫細胞分化、增殖、凋亡等生物學行為的調節中發揮至關重要的作用，其中程序性死亡分子1(programmed death 1，PD-1)和 T 細胞免疫球蛋白及免疫酪氨酸樣抑制基序(T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT)是起到負性調控作用的2種免疫調控受體，已經被證實在HIV感染患者外周血CD3+CD4-T細胞中呈高表達趨勢且與CD4+T細胞的數目呈負相關[3-4]，由此提示PD-1及TIGIT的高表達與HIV感染后CD4+T細胞功能的缺陷有關。CD4+T細胞包含了多種輔助性T細胞(T helper，Th)及調節性T細胞(regulatory T，Treg)亞群，CD4+T細胞總數發生變化的過程中，不同亞群也會出現不同的改變。為了進一步明確PD-1、TIGIT 2種免疫調控受體在HIV感染進程中所起到的作用，現分析HIV感染者外周血PD-1、TIGIT基因表達水平與T細胞分化、凋亡分子分泌的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年6月—2018年8月四川省甘孜藏族自治州人民醫院傳染病科診斷為HIV感染的患者80例作為HIV組，均符合中華醫學會感染病學分會艾滋病學組制定的艾滋病診斷標準[5]，經免疫印跡法確診為HIV陽性，均為初次確診、未接受過抗病毒治療。HIV組男49例，女31例，年齡22～54(31.93±5.83)歲；病程9～34(17.38±3.23)月；合并糖尿病29例，高血壓17例，高脂血癥14例。另取同期在醫院體檢的健康者60例作為健康對照組，男34例，女26例，年齡21～55(32.15±6.24)歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，全部受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標與方法 2組受試人員均清晨空腹采集肘靜脈血8～10 ml，-80℃置入冰箱備用。

1.2.1 PD-L1、TIGIT mRNA表達檢測： 取上述血液2～3 ml抽提RNA并反轉錄合成cDNA，按照cDNA 1 μl、UltraSYBR Mixture試劑10 μl、引物混合液0.8 μl、去離子水8.2 μl配置反應體系，進行熒光定量PCR反應后計算PD-L1、TIGIT的mRNA表達。試劑盒及UltraSYBR Mixture試劑購自北京康為世紀公司。

1.2.2 CD4+T細胞亞群檢測：取上述血液3～4 ml以EDTA抗凝，Ficoll密度梯度離心法分離人外周血單核細胞(PBMC)后用RPMI1640調節細胞密度至2×106/ml，每個反應管內分裝細胞懸液100 μl。避光孵育PC5標記的CD4抗體、PE標記的IFN-γ抗體后以流式細胞儀(NovoCyte 1040，艾森生物公司產品)測定Th1細胞數目。避光孵育PC5標記的CD4抗體、PE標記的IL-4抗體后在流式細胞儀上測定Th2細胞數目。避光孵育PC5標記的CD4抗體、PE標記的IL-9抗體后在流式細胞儀上測定Th9細胞數目。避光孵育FITC標記的CD4抗體、PE標記的IL-17抗體后在流式細胞儀上測定Th17細胞的數目。避光孵育FITC標記的CD4抗體、PE標記的CD25抗體、PE-cy5標記的Foxp3抗體后在流式細胞儀上測定Treg細胞的數目。

1.2.3 血清凋亡分子檢測： 取上述血液2 ml后離心分離血清，采用酶聯免疫吸附法測定B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、自殺相關蛋白因子(Fas)、Fas配體(FasL)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、TRAIL的含量，試劑盒購自上海西唐生物公司。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析。正態分布的計量資料以均數±標準差表示，2組間比較采用t檢驗；相關性分析采用Pearson檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組PD-L1、TIGIT mRNA表達水平比較 與健康對照組比較，HIV組外周血中PD-L1、TIGIT的mRNA表達水平均明顯升高(P<0.01)，見表1。

表1 2組PD-L1、TIGIT mRNA表達水平比較

2.2 2組外周血CD4+T細胞亞群數目比較 與健康對照組比較，HIV組外周血Th1、Th17細胞數目明顯降低，Th2、Th9、Treg細胞數目明顯升高(P均<0.01)，見表2。

2.3 2組血清凋亡分子含量比較 與健康對照組比較，HIV組血清Bcl-2含量明顯降低，Fas、FasL、TNF-α、TRAIL含量明顯升高(P均<0.01)，見表3。

2.4 相關性分析 HIV組外周血PD-L1及TIGIT的mRNA表達水平與外周血Th1、Th17細胞數目以及血清Bcl-2含量呈負相關(r=-0.623、-0.591、-0.657、-0.452、-0.524、-0.612，P均<0.05)，與外周血Th2、Th9、Treg細胞的數目以及血清FasL、Fas、TNF-α、TRAIL的含量呈正相關(r=0.475、0.563、0.608、0.498、0.632、0.574、0.538、0.475、0.551、0.561、0.494、0.601、0.526、0.583，P均<0.05)。

3 討 論

HIV感染后主要通過殺傷CD4+T細胞來引起免疫缺陷， 但其機制仍未完全明確。PD-1和TIGIT是在免疫細胞表面廣泛表達的2種免疫調控受體，主要對免疫細胞的分化成熟、增殖起到負性調控作用。PD-1的配體PD-L1是B7家族中的T細胞共抑制分子，PD-L1與PD-1結合后一方面能夠通過細胞內的SHP-2的磷酸化來引起T細胞表面受體通路中的多種反應發生去磷酸化，進而抑制T細胞的分化成熟；另一方面能夠直接啟動細胞內的凋亡信號通路，誘導T細胞發生凋亡[6-7]。TIGIT在與免疫酪氨酸樣抑制基序結合后能夠產生抑制性信號，進而抑制T細胞的分化成熟[8]。劉婷婷等[9]研究認為，PD-1和TIGIT 2種分子在HIV感染患者外周血CD3+CD4-T細胞中的表達明顯增多且與CD4+T細胞數目、HIV病毒載量有關。本研究結果發現，HIV組外周血中PD-L1、TIGIT的mRNA表達水平均明顯高于健康對照組。這一結果表明HIV感染患者外周血中PD-L1及TIGIT的高表達不是僅僅存在于CD3+CD4-T細胞表面，而是存在于整體水平，結合2種分子的生物學特性以及HIV病程中CD4+T細胞功能的衰竭也能夠進一步提示，PD-L1及TIGIT的高表達能夠影響HIV病程中CD4+T細胞的分化及其相應亞群的功能。

CD4+T細胞包含了多種亞群，在免疫應答過程中發揮了不同的作用[10]。Th1和Th2細胞是最早發現的CD4+T細胞亞群，Th1主要分泌IFN-γ、IL-2等細胞因子，能夠促進細胞免疫應答且能發揮抗病毒、抗腫瘤作用；Th2主要分泌IL-4、IL-5等細胞因子，能夠促進體液免疫、變態反應但容易造成病毒、腫瘤發生免疫逃逸[11-12]。Th17和Treg是新發現的一對CD4+T細胞亞群，前者主要分泌IL-17并且具有較強的促炎及刺激T細胞活化的作用，能夠增強機體的抗病毒能力；后者具有免疫抑制活性，通過分泌TGF-β1等抑制性細胞因子以及細胞間接觸抑制的方式來對免疫應答起到負性調控作用[13-14]；Th9是新發現的功能與Th2相近的CD4+T細胞亞群，其分泌的IL-9能夠通過與受體IL-9R結合來抑制免疫功能[15]。本研究對HIV感染患者外周血中CD4+T細胞亞群的分析發現，HIV組外周血中Th1、Th17細胞的數目明顯低于健康對照組，Th2、Th9、Treg細胞的數目明顯高于健康對照組。這一結果表明雖然HIV感染能夠直接攻擊和殺傷CD4+T細胞，使CD4+T細胞的總數降低，但不同CD4+T細胞亞群的變化仍存在差異，具有細胞免疫應答活性的Th1及Th17亞群分化受阻，具有免疫抑制活性的Th2、Th9、Treg亞群分化反而增強，進而有利于HIV脫離免疫應答的監視、不斷繁殖并加重其對免疫功能的破壞。進一步分析外周血PD-L1及TIGIT表達與HIV感染患者CD4+T細胞亞群的關系可知，PD-L1、TIGIT的表達水平與Th1、Th17的數量呈負相關，與Th2、Th9、Treg的數量呈正相關。這一相關性的結果提示HIV感染患者外周血中高表達的PD-L1、TIGIT能夠影響CD4+T細胞亞群的分化，阻礙Th1、Th17的分化，促進Th2、Th9、Treg的分化，進而使HIV感染患者體內的免疫應答發生缺陷。

免疫細胞表面的PD-1和TIGIT一方面能夠通過阻礙細胞的分化成熟來影響免疫功能，另一方面也能直接刺激細胞凋亡程序活化、誘導細胞發生凋亡。細胞內介導凋亡的程序包括線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑。Bcl-2是在線粒體凋亡途徑中發揮抗凋亡作用的分子，能夠減少線粒體內細胞色素C的釋放并阻礙由細胞色素C介導的細胞凋亡[16]；FasL/Fas、TRAIL/TNF-α是在死亡受體凋亡途徑中發揮促凋亡作用的分子，通過配體—受體的方式結合后能夠在細胞內招募Caspase分子并促進其發生級聯激活，最終引起細胞發生凋亡[17]。本研究對HIV感染患者血清中凋亡分子含量的分析發現，HIV組血清中Bcl-2含量明顯低于健康對照組，FasL、Fas、TNF-α、TRAIL含量明顯高于健康對照組。這一結果表明HIV感染能夠造成患者體內的線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑發生過度激活，血清中抗凋亡分子的含量減少、促凋亡分子的含量增多。進一步分析外周血PD-L1及TIGIT表達與HIV感染患者體內凋亡分子分泌的關系可知，PD-L1、TIGIT表達水平與Bcl-2含量呈負相關，與FasL、Fas、TNF-α、TRAIL含量呈正相關。這一相關性的結果提示HIV感染患者外周血中高表達的PD-L1、TIGIT不僅能夠影響CD4+T細胞的分化過程，還能通過激活細胞凋亡來造成CD4+T細胞的耗竭。

表2 2組CD4+T細胞亞群數目比較

表3 2組間血清凋亡分子含量比較

綜上所述，HIV感染者外周血中PD-1、TIGIT表達明顯增多；高表達的PD-1、TIGIT一方面影響 CD4+T細胞亞群的分化，表現為阻礙Th1、Th17的分化，促進Th2、Th9、Treg的分化；另一方面影響凋亡分子的分泌，促進細胞發生線粒體途徑和死亡受體途徑的凋亡。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

歐仕穎：負責研究設計、開展及論文撰寫;余長芳、楊建蓉：負責數據收集；余海霞：負責論文審核及修改；澤汪格瑪：負責統計分析