狼瘡腎炎患者尿液低氧誘導(dǎo)因子-1α和生長轉(zhuǎn)化因子-β1的變化及意義

李敏，郭毅飛，龔麗，李雪鋒

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以多臟器功能損害為主要臨床特征的全身性、慢性、炎性結(jié)締組織疾病，常伴有皮膚、腎臟、血液系統(tǒng)、肺和心臟等受累，約70% SLE患者合并狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)，引起較高病死率。臨床中若能早期診斷及治療LN，可能對增加病情緩解幾率和改善遠(yuǎn)期預(yù)后有幫助[1]。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)是一種異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于哺乳動物和人體細(xì)胞中，可在T細(xì)胞中表達(dá)，低氧或炎性因子刺激均可促進(jìn)其表達(dá)增加，它本身也可激活免疫細(xì)胞，驅(qū)動炎性反應(yīng)，參與自身免疫性疾病、感染以及腫瘤等疾病的發(fā)生[2]。生長轉(zhuǎn)化因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是多功能肽家族的一員，是一種與腎纖維化相關(guān)的因子，較多研究證實TGF-β1高表達(dá)常參與LN患者腎間質(zhì)系膜和基質(zhì)增生，導(dǎo)致病情活動[3]。國內(nèi)外關(guān)于HIF-1α在LN患者中表達(dá)情況的研究鮮有報道，現(xiàn)比較LN患者及健康對照人群尿液HIF-1α和TGF-β1水平的差異，分析HIF-1α、TGF-β1與LN疾病活動的關(guān)系及其可能的病理生理學(xué)機(jī)制，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2014年6月—2016年10月在十堰市太和醫(yī)院內(nèi)分泌風(fēng)濕病科收治的LN患者52例和健康體檢者40例作為研究對象，LN患者均經(jīng)腎組織活檢確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：LN患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)制定的LN分類標(biāo)準(zhǔn)[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性腎臟病(CKD)4期以上及需要透析的LN患者；合并其他原發(fā)性或繼發(fā)性腎臟疾病者；嚴(yán)重心、肝、腦及其他嚴(yán)重遺傳疾病者；合并嚴(yán)重感染患者；妊娠及哺乳期患者和合并精神疾病患者。根據(jù)文獻(xiàn)報道，以狼瘡疾病活動指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)[4]對患者活動度進(jìn)行評分作為狼瘡活動分組依據(jù)：SLEDAI≥8分者33例作為活動期組，SLEDAI<8分者19例作為非活動期組。活動期組男5例，女28例，年齡22～48(33.1±13.7)歲；病理診斷：Ⅲ型10例(30.3%)，Ⅳ型12例(36.3%)，Ⅲ+Ⅴ型5例(15.2%)，Ⅳ+Ⅴ型3例(9.1%)，Ⅴ型3例(9.1%)。非活動期組男3例，女16例，年齡20～47(30.2±14.5)歲；病理診斷：Ⅱ型16例(84.2%)，Ⅰ型3例(15.8%)。2組臨床資料見表1。健康對照組均為同期于醫(yī)院健康體檢中心經(jīng)篩查的健康體檢者40例，男7例，女33例，年齡21～47(31.8±15.2)歲；血常規(guī)、肝腎功能、hs-CRP、ESR均正常，心電圖、心臟彩色超聲均正常；并排除結(jié)締組織疾病、高血壓、冠心病、肺部疾病、糖尿病、慢性腎炎、合并腫瘤和精神疾病患者。

1.2 腎臟病理學(xué)資料 按2003年國際腎臟病學(xué)會(ISN)和腎臟病理學(xué)會(RPS)制定的LN病理組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)[5]分為Ⅰ～Ⅵ型：Ⅰ型為正常或微小病變型腎小球腎炎，Ⅱ型為系膜增殖型腎小球腎炎，Ⅲ型為局灶節(jié)段增殖型腎小球腎炎，Ⅳ型為彌漫增殖型腎小球腎炎，Ⅴ型為膜性腎病型，Ⅵ型為腎小球硬化型腎小球腎炎。此分類標(biāo)準(zhǔn)，主要用于判斷LN總體預(yù)后，不能完全反映早期腎臟病理損害的炎性反應(yīng)程度。在此病理學(xué)分類基礎(chǔ)上，參照Imran等[6]評分方法，進(jìn)行狼瘡腎組織活動指數(shù)評分(AI評分)，主要參考6項指標(biāo)：腎小球白細(xì)胞浸潤計數(shù)、毛細(xì)血管增生、腎間質(zhì)炎性反應(yīng)程度、細(xì)胞性新月體數(shù)、核碎裂纖維素沉積、微血栓形成或白金耳現(xiàn)象和腎小管壞死，各項0～3分，其中新月體數(shù)等部分項目0～6分，共計積分0～24分。狼瘡性腎炎AI評分是判斷其預(yù)后的金標(biāo)準(zhǔn)，AI>10分，提示病情重及預(yù)后不良，AI與臨床表現(xiàn)及嚴(yán)重程度關(guān)系密切，AI高者，腎功能受損的可能性較大。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 HIF-1α和TGF-β1檢測： 收集研究對象清晨中段尿(女性避開月經(jīng)期)5 ml，離心提取上清液，采用ELISA雙抗夾心法測定HIF-1α和TGF-β1濃度，酶標(biāo)儀由Benchmark公司生產(chǎn)，試劑盒均由北京普生瑞達(dá)生物技術(shù)有限公司提供，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行檢測操作。

1.3.2 相關(guān)實驗室指標(biāo)檢測： LN患者入院次日、健康對照組體檢當(dāng)日晨采集肘靜脈血5 ml，離心收取上層血清待測，利用免疫熒光法檢測抗雙鏈DNA抗體(dsDNA)，免疫比濁法測定超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、24 h 尿蛋白定量、血清補(bǔ)體C3、C4濃度，魏氏法測定紅細(xì)胞沉降率(ESR)。

1.3.3 肺動脈壓檢測： 利用無創(chuàng)性心臟彩色多普勒檢查測定平均肺動脈壓力(mPAP)，由不知情且有豐富經(jīng)驗的1名超聲科醫(yī)師檢測。

2 結(jié) 果

2.1 LN患者臨床資料比較 活動期組患者AI評分、SLEDAI評分、mPAH、ds-DNA、補(bǔ)體C3、hs-CRP和24 h尿蛋白定量水平均較非活動組明顯增高(P<0.05)，2組患者年齡、補(bǔ)體C4水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 尿液HIF-1α和TGF-β1水平比較 尿液HIF-1α、TGF-β1水平活動期組患者>非活動期組>健康對照組(P<0.05)， 見表2。

表2 3組尿液HIF-1α和TGF-β1水平比較

2.3 相關(guān)性分析

2.3.1 尿液HIF-1α及TGF-β1與臨床指標(biāo)的單因素相關(guān)性分析： LN患者尿液HIF-1α與TGF-β1水平呈正相關(guān)性(r=0.534，P=0.021)。 HIF-1α與SLEDAI評分、mPAH、24 h尿蛋白量、ESR、hs-CRP、AI評分呈正相關(guān)(P均<0.05)；TGF-β1與SLEDAI評分、24 h尿蛋白定量及ds-DNA呈正相關(guān)性(P均<0.05)，與補(bǔ)體C3水平呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，見表3。

表3 LN患者尿液HIF-1α、TGF-β1水平與一般臨床指標(biāo)的相關(guān)性

2.3.2 LN患者尿液HIF-1α及TGF-β1水平與腎臟病理學(xué)的關(guān)系: LN患者尿液HIF-1α水平與腎臟病理AI評分呈正相關(guān)性(r=0.356，P=0.012)，TGF-β1與腎臟病理AI評分無相關(guān)性(r=0.042，P=0.213)。Kruskal-Wallis分析表明，尿液HIF-1α和TGF-β1水平在不同LN腎臟病理分型患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3.3 多元逐步回歸分析: 以LN活動期患者AI評分作為模型因變量，以活動組與非活動組存在差異的指標(biāo)HIF-1α、TGF-β1、AI評分、mPAH、ds-DNA、ESR、補(bǔ)體C3、hs-CRP和24 h尿蛋白定量為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果表明，尿液HIF-1α濃度、ds-DNA濃度和24 h尿蛋白定量是影響LN患者預(yù)后的獨立危險因素，見表4。

3 討 論

LN是SLE最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，回顧性臨床研究提示根據(jù)腎臟病理學(xué)檢查，幾乎所有的SLE患者在病程的不同階段均表現(xiàn)出不同程度的腎臟損害[7]。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為機(jī)體自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的激活和非自身抗原間平衡關(guān)系被打破，體液免疫亢進(jìn)是導(dǎo)致LN發(fā)生的主要原因，但近年研究發(fā)現(xiàn)SLE的嚴(yán)重程度和病變范圍與致炎和抗炎細(xì)胞因子之間的平衡關(guān)系也較為密切[8]。24 h尿蛋白定量和尿殘渣分析常被作為評價LN腎損害程度粗略的標(biāo)志物，但該指標(biāo)缺乏特異性，容易受到發(fā)熱、尿路感染等其他SLE并發(fā)因素的影響，臨床中尚缺乏能準(zhǔn)確反映不同病理類型LN損害程度、監(jiān)測病情活動和判斷預(yù)后的檢測指標(biāo)。

表1 LN活動期組與非活動期組臨床資料比較

表4 影響LN患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

HIF-1α是機(jī)體在低氧、炎性反應(yīng)等特殊環(huán)境下產(chǎn)生的一種關(guān)于適應(yīng)性細(xì)胞氧自穩(wěn)態(tài)調(diào)控因子，基礎(chǔ)研究表明HIF-1α在許多腎臟疾病中具有“雙刃劍”作用，一方面可加快細(xì)胞代謝，改善血流動力學(xué)，增強(qiáng)腎臟對缺氧的適應(yīng)性，而起到保護(hù)腎臟的作用[9]。另一方面，HIF-1α及其相關(guān)性低氧狀態(tài)會誘發(fā)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、結(jié)締組織生長因子(cTGF)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)等的合成及分泌，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的吸收和排泌障礙，誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化[10]。Feng等[11]研究表明，HIF-1α的基因功能對 SLE 患者體內(nèi)輔助性T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Th17/Treg)免疫平衡產(chǎn)生影響，血清HIF-1α水平的增高可能導(dǎo)致免疫耐受破壞，并對體內(nèi)炎性細(xì)胞因子白介素-17(IL-17)的表達(dá)量產(chǎn)生影響，與SLE疾病活動密切關(guān)聯(lián)。目前國內(nèi)尚無關(guān)于HIF-1α在LN患者中作用及作用機(jī)制的相關(guān)報道，本研究表明，LN患者尿液HIF-1α水平較正常人明顯增高，且LN活動期組患者尿液HIF-1α水平高于非活動期組，LN患者HIF-1α水平與mPAH、SLEDAI評分等多項疾病活動標(biāo)志物呈正相關(guān)性，提示HIF-1α在反映SLE整體病情活躍中的預(yù)測作用。Logistic回歸分析結(jié)果則進(jìn)一步確認(rèn)了尿液HIF-1α濃度是影響LN患者疾病活動的獨立危險因素。

Ogura等[12]進(jìn)行的動物研究表明HIF-1α對缺血導(dǎo)致腎損害鼠模型病理影響以腎間質(zhì)損害為主，表現(xiàn)為腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞浸潤及出現(xiàn)纖維化。其他研究發(fā)現(xiàn)，LN患者和MRL/lpr狼瘡腎炎模型小鼠腎小球和腎間質(zhì)均有HIF-1α表達(dá)量的增加，并且病理檢查可見大量間充質(zhì)細(xì)胞(MCs)浸潤，而經(jīng)治療或HIF-1α阻斷劑(dimethyloxaloylglycine，DMOG)處理后，腎臟炎性反應(yīng)活動可明顯減輕[13]。本研究表明LN患者HIF-1α水平與腎臟病理AI評分呈正相關(guān)性，且在以腎小球細(xì)胞增殖性改變和纖維素樣壞死為主要表現(xiàn)的Ⅲ型、Ⅵ型LN患者中有增高趨勢，與動物實驗的病理表現(xiàn)存在一定差異性。推測產(chǎn)生差異的原因可能為HIF-1α在不同哺乳動物腎臟的表達(dá)存在差異，對免疫功能的影響作用也不盡相同。此外，本研究LN患者腎功能異常者較少，腎臟損害程度并不十分嚴(yán)重，此種情況下腎小球濾出的HIF-1α可在近端腎小管部分被重吸收，不能完全反映出不同病理類型中其表達(dá)量的差異性。肺動脈高壓是反映SLE活動性及判斷預(yù)后的重要依據(jù)，肺動脈高壓與LN的發(fā)生有密切聯(lián)系[7]。本結(jié)果表明LN患者HIF-1α與mPAH呈正相關(guān)性。動物研究表明HIF-1α可通過上調(diào)VEGF和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，促進(jìn)肺動脈內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)血管生成，加速缺氧性肺動脈高壓[14]。故而推測SLE患者體內(nèi)HIF-1α的變化可能促進(jìn)了SLE肺動脈高壓的形成，尚需更多的基礎(chǔ)與臨床研究證實。

TGF-β1為廣泛存在于人類和其他哺乳動物多功能肽超家族中的一員，人體內(nèi)主要有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3的表達(dá)，它們具有相似的生物學(xué)特性。TGF-β1是一種與纖維化關(guān)系密切的細(xì)胞因子，通常由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，在組織纖維化中具有重要作用[15]。基礎(chǔ)研究表明腎小管液中高濃度TGF-β1能誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1)的表達(dá)，增加單核—巨噬細(xì)胞在腎組織中浸潤，并可通過促進(jìn)細(xì)胞外膠原沉積，增加腎小管上皮細(xì)胞增殖與分化等多種生物學(xué)效應(yīng)，導(dǎo)致腎小球炎性反應(yīng)和腎臟間質(zhì)纖維化[16]。石鑫岳等[17]通過對不同病理類型的LN患者尿液標(biāo)志物進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在以系膜和基質(zhì)增生為主要病理特點的系膜增生腎小球腎炎、膜性腎小球腎炎和新月體性腎小球腎炎的患者中尿液TGF-β1水平增加較為明顯。本項研究中，LN活動期患者尿液TGF-β1表達(dá)量明顯增加，與Susianti等[18]報道基本一致。LN患者尿液TGF-β1水平與AI評分、SLEDAI評分、24 h尿蛋白定量及ds-DNA等常見的SLE疾病活動度的臨床指標(biāo)呈正相關(guān)性，而與補(bǔ)體C3水平呈負(fù)相關(guān)性，推測TGF-β1可能通過某些生物學(xué)作用，導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)功能亢進(jìn)，消耗大量補(bǔ)體C3，造成低補(bǔ)體血癥，誘發(fā)SLE疾病活動。此外，本研究發(fā)現(xiàn)LN患者尿液HIF-1α與TGF-β1濃度呈正相關(guān)性，并且HIF-1α與患者疾病活動呈顯著相關(guān)性，提示HIF-1α可能作為TGF-β1的一種調(diào)控因子，通過激活某些潛在信號通路介導(dǎo)TGF-β1的過度表達(dá)，加重SLE腎損害。但是，本研究LN患者HIF-1α與TGF-β1濃度并未在不同LN腎臟病理學(xué)AI評分及腎臟病理類型患者中表現(xiàn)出完全一致性變化，提示二者在LN中的作用非常復(fù)雜，而患者腎臟病理AI評分同樣也會受到SLE 長期病程中多種混雜因素的影響，該研究并不一定能夠完全反映LN部分患者潛在的疾病活動狀態(tài)。

總之，LN的發(fā)生是一個原因復(fù)雜、多因素共同參與的結(jié)果，本研究提示HIF-1α和TGF-β1水平的增加可能參與LN的發(fā)病，并且與疾病活動度關(guān)系密切，后續(xù)需通過前瞻性、更大樣本量的臨床研究提供更具說服力的判斷，通過深入了解二者在LN中的作用機(jī)制，尿液HIF-1α和TGF-β1的測定有可能成為LN病情檢測的重要指標(biāo)，對LN的早期治療及尋找潛在的治療靶點具有重要意義。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

李敏：設(shè)計研究方案、實施研究過程及論文撰寫；郭毅飛、龔麗：資料收集；李雪鋒：論文審核