PITX1 rs647161 位點基因多態性和環境交互作用與結直腸癌風險相關性研究

章 婷 徐 琦

最新數據顯示，2011 年估計有310,244 例新診斷為結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的病例，占所有新診斷癌癥病例的9.20%[1]。因此，結直腸癌正在成為民眾生命健康的主要威脅。CRC 是一種由生活方式、營養、身體活動等環境因素和遺傳因素等共同導致的疾病[2-4]。根據全基因組關聯研究（GWAS），配對樣同源域1（PITX1）遺傳多態性已被新確定為特異于東亞人的CRC 敏感遺傳因子[5]。目前，PITX1 基因多態性及其與環境的相互作用對CRC 發生風險的影響還缺少相關研究。PITX1 rs647161 位于5q31.1 區的5 號染色體上，其中一組單核苷酸多態性（SNPs）與CRC 發生有關[6]。在該區域的基因中，PITX1 最接近rs647161（上游約129kb）[7]。PITX1 在CRC 致癌過程中發揮重要作用，被認為是腫瘤抑制基因[8]。本研究采用病例對照研究的形式分析PITX1基因rs647161 位點單核苷酸多態性與CRC 易感性及其嚴重程度的相關性，具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014 年5 月—2017 年12 月期間杭州市富陽區第二人民醫院和浙江省腫瘤醫院收治的CRC 患者120 例作為研究組，所有患者均接受結直腸癌根治術治療，并能夠取得組織進行病理診斷。TNM 分期：I 期22 例，II 期23 例，III 期35 例，IV 期40 例。根據研究組患者年齡、性別匹配在醫院體檢中心招募120 名健康體檢者作為對照組。本研究經醫院倫理委員會審核通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 納入、排除標準 納入標準：（1）所有患者均經臨床確診后通過組織病理學證實為CRC[9]；（2）功能狀態評分≥60 分[10]，（3）具有明顯可測量的病灶。排除標準：（1）肝腎功能異常；（2）由兩位經驗豐富的副主任醫師共同判定認為預計生存期＜6 個月；（3）對化療藥物不耐受。

表1 結直腸癌患者與健康體檢者一般資料比較（

表1 結直腸癌患者與健康體檢者一般資料比較（

注：BMI：身體質量指數；研究組：結直腸癌患者；對照組：健康體檢者

組別研究組對照組t/χ2 值P 值例數120 120年齡（歲）57.54±10.11 58.43±12.32 0.61 0.54男性[n（%）]80（66.67）84（70.00）0.31 0.58 BMI（kg/m2）23.42±2.76 24.14±3.01 1.87 0.06吸煙[n（%）]34（28.33）32（26.67）0.08 0.77飲酒[n（%）]43（35.83）40（33.33）0.17 0.68家族史[n（%）]11（9.17）3（2.50）4.85 0.03

1.3 方 法 取受試者靜脈血約3mL，使用血液基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號DP318-02，批號2014051306）提取基因組DNA，使用primer premier 5.0 設計rs647161 位點PCR 擴增引物序列為上游：5’-GAAGGACCTGTGGTTGGTG A-3’；下游：5’-GGCTTGAAACCTCTACCTGGG-3’。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成后稀釋成10pmol 的工作液。PCR 反應的體系為：DNA 模板50ng，2.5μL 10×buffer，1.5μL 25mM Mg2+，0.5μL 10mM dNTP，0.5μL 5U Taq 酶，10pmol 的上下游引物各0.5μL，用水補足25μL。PCR 后直接將PCR 產物寄送蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序，正反方向測序，結果見圖1。

圖1 PITX1 rs647161 位點各基因型測序結果

1.4 臨床參數收集 收集所有受試者的年齡、性別、身體質量指數（body mass index，BMI）、吸煙狀況、飲酒狀況、CRC 家族史以及CRC 患者的TNM 分期。

1.5 統計學方法 本研究所有數據的統計學分析均采用SPSS20.0 軟件，計數資料用頻數[n（%）]表示，組間統計學分析采用χ2檢驗。計量資料的表示方法為均數±標準差s） ，組間統計學分析采用t 檢驗，基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg 平衡采用χ2檢驗。采用非條件Logistic 回歸模型估計優勢比（OR）和95%置信區間（CI）。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料比較 研究組和對照組年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒等一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），研究組患者有CRC 家族史的比例顯著高于對照組，差異有統計學意義（χ2=4.85，P=0.03），見表1。

2.2 PITX1 rs647161 位點基因多態性與CRC 風險相關性 PITX1 rs647161 位點基因型頻率符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。研究組和對照組PITX1 rs647161 位點基因型頻率比較，差異有統計學意義（χ2=7.70，P=0.02）。以野生型為參考，兩組雜合子（CA）基因頻率比較，差異無統計學意義（OR=1.04，95%CI=0.56～1.93，P=0.91），純合子（AA）是CRC 的危險因素（OR=2.78，95%CI=1.22～6.39，P=0.01）。研究組A 等位基因頻率顯著高于對照組（χ2=6.99，P=0.01），A 等位基因是CRC 的高風險因素（OR=1.69，95%CI=1.12～2.53，P=0.01），見表2。

表2 結直腸癌患者與健康體檢者PITX1 rs647161 位點基因型和等位基因頻率比較

2.3 PITX1 rs647161 位點基因多態性和環境因素交互作用與CRC 風險相關性 在男性攜帶A 等位基因患CRC 風險沒有顯著升高（OR=1.11，95%CI=0.58～2.16，P=0.73），女性攜帶A 等位基因患CRC 風險顯著升高（OR=3.70，95%CI=1.13～12.57，P=0.01）。在年齡＜50 歲的A 等位基因攜帶者CRC 風險沒有顯著升高（OR=0.89，95%CI=0.41～1.91，P=0.74），而年齡≥50 歲的A 等位基因攜帶者CRC 風險顯著升高（OR=2.61，95%CI=1.13～6.04，P=0.01）。BMI＜25kg/m2的A 等位基因攜帶者沒有CRC 發生風險（OR=0.87，95%CI=0.45～1.68，P=0.66），而BMI≥25kg/m2的受試者攜帶A 等位基因時CRC 發生風險顯著升高（OR=5.33，95%CI=1.58～18.83，P＜0.01）。吸煙的A 等位基因攜帶者具有較高的CRC 患病風險（OR=4.33，95%CI=1.09～18.60，P=0.02），而不吸煙的A 等位基因攜帶者患CRC 風險并未顯著升高（OR=1.16，95%CI=0.61～2.20，P=0.64）。飲酒的A 等位基因攜帶者具有較高的CRC 患病風險（OR=4.49，95%CI=1.41～14.88，P＜0.01），而不飲酒的A 等位基因攜帶者患CRC 風險并未顯著升高（OR=0.98，95%CI=0.50～1.94，P=0.96）。有CRC 家族史和沒有CRC 家族史的A 等位基因攜帶者患CRC 的風險均沒有顯著升 高（OR=0.27，95%CI=0.02 ～3.06，P=0.20；OR=1.27，95%CI=0.73～2.22，P=0.37），見表3。

2.4 PITX1 rs647161 位點基因多態性與CRC 嚴重程度相關性 以野生型（CC）為參考，雜合子（CA）和純合子（AA）的CRC 患者TNM 分期在III 期和IV 期的比例顯著高于I 期和II 期（OR=3.42，95%CI=1.25～9.57，P=0.01；OR=7.39，95%CI=2.06～28.94，P＜0.01），見表4。

3 討 論

CRC 是我國乃至世界上許多其它地區最常診斷的惡性腫瘤之一[11]。近年來分子生物學和癌癥遺傳學的創新提高了對散發性和遺傳性CRC 發病機制的理解[12-14]。用于分析基因組的復雜分子技術的發展使得能夠鑒定涉及CRC 發病機理的若干遺傳改變。

PITX1 是一種與bicoid 相關的同源域因子，是一種已知的轉錄因子，在發育中的垂體前葉腺中表達[15]。研究顯示，PITX1 基因是一個抑癌基因，與CRC 的發展關系密切[8]。在研究PITX1 基因遺傳變異時發現rs647161 位點多態性是疾病發生的重要風險因素，目前其功能尚未明確，該位點也不存在與任何已知的轉錄或者調解序列中[8]。雖然rs647161 具有不明確的功能，但全基因組關聯研究（GWAS） 顯示，rs647161 位點SNP 與CRC 發生具有一定聯系[16-17]。PITX1 和該家族的其他成員參與胚胎發育[18]。此外，這些基因控制成熟組織的分化和增殖，并可作為腫瘤抑制基因在致癌過程中起到因果作用[19]。本研究結果發現，研究組患者中有CRC 家族史的比例顯著高于對照組，說明CRC 家族史是CRC 的危險因素，與聶泓宇等[20]研究結果一致。分析結果顯示，研究組和對照組PITX1 rs647161 位點基因型頻率之間的差異顯著，AA 基因型患CRC 的風險相比CC 基因型提高2.78 倍，A 等位基因攜帶者患CRC 的風險比C 等位基因高1.69 倍。從本研究結果可以看出，rs647161 位點基因檢測可能對于臨床上CRC 的預防具有重要意義。CRC 是遺傳因素與環境因素共同決定的結果，因此本研究同時還分析了rs647161 位點與環境因素相互作用的情況，結果顯示在男性、年齡＜50 歲、BMI＜25kg/m2、不吸煙、不飲酒這幾類人群中rs647161位點A 等位基因攜帶者患CRC 的風險并沒有顯著提高，相反在女性、年齡≥50 歲、BMI≥25kg/m2、吸煙、飲酒這幾類人群中A 等位基因攜帶者患CRC 的風險顯著高于C 等位基因攜帶者，提示rs647161 位點與年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒等因素之間存在相互作用影響CRC 患病風險。與此同時，我們發現在有CRC 家族史和沒有CRC 家族史受試者中A 等位基因攜帶者患CRC 的風險并沒有顯著差異，由此說明rs647161 位點與CRC 家族史之間并沒有顯著相互作用。然而，由于本研究樣本量有限，該研究發現可能還需要進一步擴大樣本量進行研究。

表3 不同臨床參數組PITX1 rs647161 位點基因多態性與CRC 風險的相關性分析

表4 PITX1 rs647161 位點基因多態性與TNM 分期之間的相關性

另外，本研究還分析了rs647161 位點基因多態性與CRC 患者疾病進展情況，我們主要是通過分析rs647161 位點基因多態性與CRC 患者TNM 分期之間的相關性，結果顯示雜合子（CA）相比野生型疾病進展為III/IV 的風險升高了3.42 倍，純合子（AA）相比野生型疾病進展為III/IV 的風險升高了7.39 倍，由此說明rs647161 位點基因多態性與CRC 患者疾病進展顯著相關。盡管目前這些研究結果的具體機制并不清楚，但是該研究發現對于我們更好的理解癌癥的病因學和預測癌癥風險并采取預防措施具有積極的意義。

綜上所述，PITX1 rs647161 位點基因多態性與CRC 風險和疾病進展有關，A 等位基因和性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素的交互作用增加患CRC的風險，為了更好的預測和預防CRC 的發生，可能需要進一步擴大樣本量進行研究。