不同產地益母草種質HPLC 指紋圖譜分析

邵璐彬 徐建中 羅頁思 孫乙銘 王志安

益母草（Leonurus japonicus Houtt）為唇形科一年生或二年生草本植物，具有調經，行血生血、祛瘀、消水、安胎等功效，是中醫治療婦科疾病運用廣泛的中藥之一，也是婦科要藥。益母草藥材的主要有效成分是生物堿類，主要為益母草堿（leonurine）、水蘇堿（stachydrine）、和益母草啶（leonuridine）、益母草寧（leonurinine）等，在各生物堿中，以水蘇堿含量較高，其次是益母草堿[1]。由于益母草傳統采收是在花前期，此時益母草堿等生物堿含量非常低，基本上不符合藥典規定[2]。而當年播種當年采收的益母草，均不發生抽苔，植株呈“芥菜”型，莖極短，葉片數多，由于益母草生物堿含量主要集中在葉片中，因此植株益母草堿等生物堿含量高，而且不同產地的益母草生物堿成分含量差異較大。本試驗主要通過HPLC 色譜指紋圖譜技術分析評價不同產地的益母草在生物堿類成分方面的差異性，為益母草優良品種的選育提供科學依據。

1 材料與儀器

Aglient HP1200 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；二極管陣列檢測器（DAD）（美國安捷倫公司）；AB204-S 型電子天平（Mettler Toledo 公司）；C18 柱（250mm×4.6mm，5μm）（北京迪科馬科技有限公司）；恒溫水浴鍋（江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠）。鹽酸益母草堿對照品111823-201303（中國食品藥品檢定研究院）；無水乙醇（杭州化學試劑有限公司）；乙腈（色譜純）（默克股份有限公司）；甲酸（上海麥克林生化科技有限公司）。

供試材料益母草種子來源（見表1），將各益母草種質統一種植在浙江省義烏市和溪村益母草種質資源圃，經浙江省中藥研究所徐建中高級工程師鑒定為益母草，取營養生長期未開花鮮益母草，70℃烘干，粉碎（過三號篩）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18 柱（250mm×4.6mm，5μm），北京迪科馬科技有限公司提供；進樣量：20μL；檢測波長：277nm；柱溫：30℃；流速：1mL/min；流動相：乙腈-0.1%甲酸；流動相梯度洗脫比例見表2。

表2 梯度洗脫流動相比例

2.2 標準品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的鹽酸益母草堿對照品0.0035g，置10mL 容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再取1mL 置10mL 容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻制成每1mL 含35μg 的溶液，作為對照品溶液。對照品色譜圖見圖1。

圖1 標準品色譜圖（鹽酸益母草堿）

2.3 供試品溶液制備 精密稱取約1g 益母草藥材粉末（過三號篩）置具塞平底燒瓶中，精密加入50mL水，稱定重量，加熱回流3h，補重過濾，精密量取20mL 濾液至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取4 次，收集乙酸乙酯層蒸干，再用70%乙醇定容至10mL，過濾進樣。

2.4 方法學考察

2.4.1 色譜指紋峰的標定 以參照物鹽酸益母草堿對應的色譜峰的保留時間和峰面積為1，計算其他各色譜指紋峰的相對保留時間及相對峰面積[3]。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取同一益母草樣品溶液，重復進樣6 次，按“2.1”項的方法進樣，考察各峰相對保留時間、相對峰面積及RSD 值。結果表明共有峰相對保留時間的RSD 在0.31%～1.0%之間，相對峰面積的RSD 在0.78%～2.33%之間，均＜5%，表明實驗儀器精密度良好。

2.4.3 重現性試驗 精密稱取同一益母草樣品6份，按“2.3”項方法制備供試品，按“2.1”項的方法進樣，考察各峰相對保留時間、相對峰面積及RSD 值。結果表明共有峰的相對保留時間的RSD 在0.18%～0.62%之間，相對峰面積的RSD 在1.12%～2.45%之間，均＜5%，表明該實驗方法重現性良好。

2.4.4 穩定性試驗 精密吸取同一益母草樣品溶液，室溫下放置，在2、4、6、12、24h 按“2.1”項的方法進樣測定，考察各峰相對保留時間、相對峰面積及RSD 值。結果表明共有峰相對保留時間的RSD 在0.18%～0.62%之間，相對峰面積的RSD 在1.13%～2.81%之間，均＜5%，表明供試品溶液24h 內穩定。

2.4.5 共有指紋峰的標定 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A）”對每個品種的指紋圖譜進行分析，得到指紋圖譜[4]以及共有模式指紋圖譜，見圖2、圖3。

通過對15 個種質的指紋圖譜的分析，發現不同來源的益母草存在差異，如圖2 所示，15 個樣品一共有24 個共有峰，峰匹配數達10 個以上樣品的峰有38 個，其中吉林通化在108min 左右有較強吸收峰，其余種質在該處幾乎沒有吸收峰，另外，各品種共有峰面積差異也較顯著。

圖2 不同品種益母草HPLC 指紋圖譜

圖3 益母草共有模式指紋圖譜

2.4.6 相似度分析 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A）”進行數據分析處理，采用多點校正將色譜峰自動匹配，生成對照圖譜。將其他樣品的色譜峰與對照圖譜進行自動匹配，計算S1～S15 樣品與對照圖譜的相似度，結果表明益母草各種質相似度較高，都在0.92 以上，見表3。

2.4.7 聚類分析 在Aglient 色譜工作站中將指紋圖譜的所有峰進行自動積分，以峰面積為聚類依據，用SPSS 統計軟件對數據進行聚類統計分析，得到聚類結果，見圖4。

如圖4 所示，聚類分析結果將15 個種質資源分為四類，第1 類包括9 個種質（湖北孝感、浙江義烏、浙江衢州B、湖南桂東、浙江寧海、吉林通化、江西修水、浙江白龍橋、山東臨朐）；第2 類包括2 個種質（河南南陽、河南靈寶）；第3 類包括3 個種質（浙江衢州A、廣西桂林、河南社旗），第4 類為云南陸良種質。

表3 益母草指紋圖譜相似度

圖4 不同益母草品種指紋圖譜聚類分析結果

2.4.8 主成分分析 在Aglient 色譜工作站中將指紋圖譜的所有峰進行自動積分，以峰面積為聚類依據，用SPSS 統計軟件對數據進行PCA 統計分析，得到主成分分析圖，見圖5。主成分分析的結果基本與聚類分析結果一致，浙江衢州A、廣西桂林與河南社旗三個種質可以看作一個區，河南南陽與河南靈寶可以看作一個區，吉林通化與江西修水可以看作一個區，云南陸良與浙江義烏等種質相對其他地區稍遠，可以看作單獨分類。

3 討 論

圖5 主成分分析圖

3.1 提取方法的考察 本實驗曾對比研究了水提醇沉法、水提法-過柱純化法、水提法-有機溶劑萃取法等方法。過柱純化法選擇強酸性陽離子樹脂[5]為交換樹脂，有機溶劑萃取分別選擇氯仿、乙酸乙酯、正己烷三種不同溶劑萃取，將得到的色譜圖結果與對照品圖譜進行比較，結果顯示過柱純化法與乙酸乙酯萃取法，均能提取出鹽酸益母草堿，考慮到實驗操作步驟及時間，確定以水提法-乙酸乙酯萃取法為適宜提取方法。

3.2 提取時間和萃取次數的考察 曾分別試驗了加熱回流時間為1、2、3、4h，并分別用乙酸乙酯萃取5次，收集乙酸乙酯層蒸干，再用70%乙醇定容至10mL，過濾、進樣。結果顯示：隨著提取時間延長，藥材中提取的有效成分含量越高，提取3h 與提取4h的含量無較大差異，因此確定回流提取時間為3h。回流后曾試驗用乙酸乙酯萃取2、3、4、5 次，收集乙酸乙酯層蒸干，再用70%乙醇定容至10mL，過濾、進樣，結果顯示：萃取4 次，測得的含量已基本穩定，因此確定萃取次數為4 次。關于萃?。涸诶靡宜嵋阴ポ腿r，溶液乳化程度較高，可能是實驗環境溫度過低，嘗試對萃取比例進行調整，發現當乙酸乙酯：水溶液=2:1 時，乳化程度大大減弱。

3.3 色譜條件考察 曾分別試驗了237、257、277 和297nm 等四種波長進行測定，結果表明277nm 波長測定時具有較好的紫外吸收和豐富的色譜峰信息，因此確定了以277nm 作為檢測波長。還分別考察了20℃、25℃、30℃柱溫下的色譜圖，發現25℃與30℃色譜峰分離效果較好且無明顯差別，考慮柱子因素，確定柱溫為30℃。另外，還分別試驗了以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸等為流動相，結果表明以乙腈-0.1%甲酸梯度系統時各色譜峰分離較好，通過試驗確定了適宜的梯度洗脫程序。

3.4 益母草主要有效成分為生物堿類，有文獻表明受到物候、光照強度和土壤水分的影響，不同產地益母草藥材生物堿類成分含量會有所差異[6-8]。本實驗建立了益母草中生物堿類等成分的高效液相色譜指紋圖譜，并將15 個不同產地的益母草進行比較，通過實驗分析發現，各種質之間化學成分種類相似度較高，說明益母草藥材的化學成分種類基本一致；而化學成分含量差異較大，可能是種質之間有差異。

3.5 指紋圖譜已成為國際公認的控制中藥或天然藥物質量的最有效手段[9]。目前對益母草高效液相指紋圖譜的研究，多數集中在益母草注射液及益母草膠囊，且多為鹽酸水蘇堿指紋圖譜[10-11]。鐘寧遠等[11]利用高效液相色譜法建立了益母草流浸膏指紋圖譜，得到6 個共有峰，為綜合評價和控制產品質量提供依據。本實驗通過考察采集于浙江義烏種質資源圃的15 份不同種源益母草藥材，構建益母草中鹽酸益母草堿高效液相指紋圖譜及其共有模式圖譜，得到共有峰24 個，可評價益母草藥材內在質量及品種的特異性，從而為其資源的現代化開發利用及質量控制提供科學依據。