HPV16型感染者 宮頸組織p16、Ki-67表達及早期干預的對比研究

王春蘭，陸 燕，仲玉英，季月霞，金麗芳

（江蘇省常熟市中醫院/海峽兩岸精準醫學協會HPV感染疾病專業委員會， 1.婦產科；2.病理科，江蘇 常熟 215500）

宮頸癌是女性生殖系統中最常見的惡性腫瘤。隨著我國宮頸癌早診早治工作大面積的開展，許多宮頸癌在癌前病變階段被發現，如何正確精準診斷和管理宮頸癌前病變正日益受到婦產科醫師的廣泛關注。宮頸癌及宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia， CIN）的形成都與高危型HPV感染密切相關，尤其是高危HPV16型感染，其致宮頸癌的風險排名第一，值得我們重視[1-4]。宮頸上皮內瘤變作為宮頸癌的癌前病變，如能得到及時的治療可阻斷宮頸癌的發生。目前，由于我國各地區經濟和醫療發展水平不平衡，導致CIN的診斷和治療仍存在著許多問題，其中較為突出的是CIN的治療比較混亂，存在著CIN過度治療等問題。因此，正確判斷CIN病變進展風險，尋找CIN進展的影響因子和標志物，構建CIN的干預治療的預警模式，并根據CIN不同階段的特點，結合患者的年齡以及生育要求，選擇更加合理的個體化觀察方式和治療方案，越來越受到國內外臨床醫師的廣泛重視[5-7]。本文對122例高危HPV16型感染者，依據p16、Ki-67蛋白檢測不同的表達情況給予觀察和早期干預治療。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月～2017年5月江蘇省常熟市中醫院婦科門診及住院患者中宮頸細胞學檢查正常及人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）分型檢測為高危HPV16型感染者122例作為研究對象。年齡20～68歲，平均年齡（42.2±10.8）歲，按宮頸組織p16、Ki-67蛋白的表達有無將其分為無表達組（A組）48例及表達組（B組37例和C組37例）74例，各組患者一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 診斷標準

（1）人乳頭狀瘤病毒（HPV）基因分型檢測試劑盒（中國專利號：02102795.1，廣東凱普生物科技有限公司）以快速雜交儀，檢測結果：高危HPV 16型陽性。免疫組化試劑：采用P16/MTS1（產品編號：MAB-0223，克隆號：6H12，規格6ml），Ki-67（產品編號：RMA-0542，克隆號：SP6，規格6ml）均購置福州邁新生物技術開發有限公司。

（2）宮頸組織病理活檢取樣：采用窺陰器充分暴露宮頸，用棉拭子擦去宮頸口過多的分泌物，用醋酸棉球順時針涂宮頸口兩圈，稍等數分鐘，觀察宮頸，如為醋酸白試驗陰性，按3、6、9、12點四點組織取樣，如為醋酸白試驗陽性，除3、6、9、12點四點組織取樣外，再加上醋酸白試驗陽性點組織取樣。

（3）宮頸組織活檢病理診斷：①正常或炎癥；② CIN，按宮頸病變的輕中重分為CINI級、CINII級、CINIII級；③早期浸潤癌（包括微小浸潤癌）；④浸潤癌。

（4）結果判定：①高危HPV 16型：每例標本檢測結束后，對每張膜片進行閱膜，判斷膜片上藍色信號所處基因型編號的位置，點和號對應，記錄HPV的基因型16號位置為一藍色信號確定單一型HPV16型陽性，所有被選病例均為HPV16型單一型感染者。②免疫組化：p16陽性位于細胞核或細胞質，染色模式顯示為彌漫型（呈棕黃色或棕褐色顆粒或粗顆粒），即宮頸鱗狀上皮基底層和副基底層的細胞呈現出連續染色，伴或不伴有表層細胞著色，判斷p16為（+）；宮頸鱗狀上皮無染色、孤立細胞或小細胞群的染色（斑駁狀染色）均判斷為（-）。Ki-67陽性位于細胞核（呈棕黃色），宮頸鱗狀上皮層除基底層和基底旁層外的細胞核染色，判斷Ki-67為（+），無染色判斷為（-）。

1.3 納入標準

（1）陰道分泌物異常增多、異味、瘙癢或夾血絲；（2）HPV16型感染者，年齡＞20歲，有性行為二年以上，均無子宮切除術、宮頸手術史、當前未懷孕；（3）能配合完成陰道鏡檢查及活檢，有關病史的采集；（4）知情同意、能自愿納入采集病例。以上4項均滿足者，才能納入研究，如果以上任何一項回答“否”，則不納入研究。

1.4 排除標準

（1）無性生活史、妊娠期或哺乳期女性；（2）陰道鏡活檢常規病理提示：無宮頸上皮內瘤變（≥CIN I）；（3）排除非生殖系統惡性腫瘤患者；（4）合并有肝腎、腦血管、心血管和造血障礙等原發性疾病者；（5）精神病患者；（6）非單一HPV16型感染者或HPV16型伴一種以上型別感染者；如果以上任何一項回答“是”，則該患者將不被納入研究范疇。

1.5 研究方法

入組病例為高危HPV 16型感染者均采用陰道鏡和宮頸組織活檢，陰道鏡活檢常規病理提示：無宮頸上皮內瘤變（≥CIN I），同時對宮頸組織行免疫組化p16、Ki-67蛋白檢測，依據p16、Ki-67蛋白的表達情況分為無表達組（A組）及有表達組（B組和C組），宮頸活檢組織p16、Ki-67蛋白無表達組觀察一年，再行宮頸HPV分型檢測+活檢。宮頸活檢組織p16、Ki-67蛋白表達者分二組，一組為藥物（使用重組人干擾素α-2b栓：陰道塞藥，每例感染者每月連續用10天，用三個月）治療組（B組），一組為LEEP術治療組（C組），p16、Ki-67蛋白表達治療組一年后再復查HPV型別+活檢。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以表示，采用t檢驗；計數資料以例數（n）、百分數（%）表示，采用x2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組高危HPV16型轉陰率比較

A 組轉陰率最低，C 組轉陰率最高，三組之間高危H P V 1 6 型轉陰率兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組高危HPV16型轉陰率比較

2.2 一年后各組CIN病變發生率比較

p16、Ki-67蛋白無表達的觀察組（A組）一年后發展為CIN病變者共18例，其中CIN I級病變13例，占72.22%，CIN II級病變4例，占22.22%，CIN III級病變1例，占5.56%，總的CIN病變發生率為37.50%；p16、Ki-67蛋白表達組（B組）發展為CIN病變者共9例，其中CIN I級病變7例，占77.78%，CIN II級病變1例，占11.11%，CIN III級病變1例，占11.11%，總的CIN發生率為24.32%；p16、Ki-67蛋白表達組（C組）無發展為CIN病變者，總的CIN病變發生率為0。見表2。

表2 各組CIN病變發生率比較

3 討 論

近十多年來，我國女性宮頸癌的發病呈現出兩大特點：一是發病人數仍在上升，二是發病年齡年輕化，其發病率每年仍以2%～3%的速度增加。宮頸癌是目前人類所有惡性腫瘤中病因學最明確的腫瘤，高危型HPV持續感染與宮頸癌的發生、發展有著密切的關系。高危型HPV有數十種之多，各個型別之間致癌力存在著明顯的差異性，其中高危HPV16型致癌性最強，同時宮頸癌也存在著一個較長的宮頸上皮內瘤變（CIN）期，這就給臨床婦產科醫師留下了充足的干預治療時間[4，8]。因此，臨床上高危型HPV分型檢測和預測CIN病變的進展已受到了前所未有的重視。單獨將高危型HPV作為一線檢測手段存在著一些缺陷，從而對高危型HPV預測CIN進展的價值產生一定的影響。p16的表達主要與宮頸癌前病變（即CIN病變）程度有關，可作為高危型HPV感染陰性的宮頸鱗狀細胞癌及癌前病變的診斷指標[9]。如能將高危型HPV分型檢測和p16和Ki-67蛋白檢測組合應用，對臨床醫師判斷宮頸病變的進展和風險，適時采取干預治療有著重要的指導意義。

p16為一種抑癌基因，其p16基因編碼的蛋白是一種細胞周期蛋白D依賴性激酶的抑制劑，當宮頸細胞被高危型HPV感染后，高危型HPV的E7蛋白競爭性抑制細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）與視網膜細胞瘤蛋白（Rb）的結合，使得Rb失去活性，同時激活了轉錄因子E2F，使其基因轉錄水平上調，從而導致p16蛋白過度表達，可檢測到p16蛋白。Ki-67為一種細胞增殖核抗原，Ki-67蛋白表達的水平提示細胞的增殖狀態。p16已成為一種宮頸早期惡性病變的指標，能夠在早期有效地判斷宮頸病變走向，并采取積極治療措施，對遏制宮頸癌前病變的進展，促進腫瘤治療均有顯著優勢。Ki-67是一個判斷腫瘤的惡性程度及轉移情況的標志物，對腫瘤增殖、浸潤的評估價值較高[7，9]。高危型HPV感染與p16和 Ki-67表達之間存在著相關性和互補性，三者共同檢測的價值更高。

本研究高危HPV16型感染者一年后轉陰率比較：A組（p16、Ki-67蛋白無表達，觀察組）一年后高危HPV16型轉陰率為37.50%，B組（p16、Ki-67蛋白有表達，藥物治療組）一年后高危HPV16型轉陰率為45.95%，C組（p16、Ki-67蛋白有表達，LEEP術治療組）一年后高危HPV16型轉陰率為89.90%，觀察組HPV16型感染者轉陰率最低，低于藥物治療組和LEEP術治療組，三組高危HPV16型轉陰率之間對比均有顯著差異性，具有統計學意義（P＜0.05）。提示高危HPV16型感染可增加發生高級別鱗狀上皮內瘤樣病變及宮頸癌風險，所以高危型HPV16感染的婦女應結合p16、Ki-67檢測結果進行干預治療，干預治療比不干預治療，高危HPV16型一年后轉陰率要高，以LEEP術干預治療，高危HPV16型轉陰率效果最好。

高危HPV16型感染者一年后三組CIN病變發生率的比較：A組（p16、Ki-67蛋白無表達，觀察組）觀察一年后發展為CIN病變者共18例，其中CIN I級病變者13例，占72.22%（13/18），CIN II級病變者4例，占22.22%（4/18），CIN III級病變者1例，占5.56%（1/18），總的CIN病變發生率為37.50%（18/48）；B組（p16、Ki-67蛋白有表達，藥物治療組）一年后發展為CIN病變者共9例，其中CIN I級病變者7例，占77.78%（7/9），CIN II級病變者1例，占11.11%（1/9），CIN III級病變者1例，占11.11%（1/9），總的CIN病變發生率為24.32%（9/37）；C組（p16、Ki-67蛋白有表達，LEEP術治療組）一年后無發展為CIN級病變者，總的CIN發生率為0.00%（0/37）。觀察組中高危HPV16型感染者總的CIN病變發生率最高，高于藥物治療組和LEEP術治療組，三組高危HPV16型感染者之間總的CIN病變發生率對比，差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示高危HPV16型感染者通過干預治療，宮頸CIN II級以上病變的發生率明顯下降。女性宮頸CIN病變與高危型HPV感染有關，宮頸CIN病變級別越高，高危型HPV感染率也隨之增高。由于高危型HPV型別很多，其致癌性強弱與高危型HPV型別密切相關，高危HPV16型致癌性最強。高危HPV16型感染宮頸后會增加發生CIN II級以上病變及宮頸癌的風險，以至高危HPV16型感染的觀察組出現了CIN II級和CIN III級病變患者，應引起臨床醫師的高度關注。對高危HPV16型感染的CIN II級以上病變經過治療后的患者更應予以密切的隨訪，HPV的基因型檢測應被視為治療后隨訪的重要指標。間隔時間至少6個月行HPV分型檢測。同時配合細胞學檢查及p16、Ki-67蛋白檢測，以便發現宮頸高級別病變。

綜上所述，CIN病變的發生和進展與高危型HPV感染密切相關，高危HPV 16型感染在全球范圍內均為最主要的致癌型別，致癌力最強，其檢測率一般超過60%以上[4，10，11]。選擇致癌力最強的高危HPV16型感染者作為研究對象，對其他高危型HPV感染者有著借鑒和參考作用，用p16、Ki-67蛋白檢測對高危HPV16型感染者進行分流是選擇早期干預治療者的一個重要指標，它們可彌補高危HPV檢測敏感性過高和高危HPV檢測陰性造成的缺陷[7-9]。p16、Ki-67蛋白檢測陰性而高危HPV16型感染者，一年內可發生CIN病變患者，其CIN II級以上病變的發生率明顯比兩組經干預治療的高危HPV16型感染者要高的多。因此，對這類高危HPV16型感染者，半年后可行高危HPV16型和p16、Ki-67蛋白復檢，必要時行宮頸活檢。p16和Ki-67的表達與宮頸癌前病變的級別密切相關已得到公認，在高危HPV陰性的高級別CIN病變中，p16陽性可作為高危HPV感染所致的宮頸鱗狀上皮內瘤變的替代的標志物[9，12]。由于HPV疫苗不能解決宮頸癌預防所有問題，宮頸癌的早期干預治療仍然是未來研究的方向，宮頸癌前病變干預治療的手段和方法仍需要我們在臨床上不斷地探索和總結，期待著多中心大樣本的深入研究。