基于納米銀顆粒團聚反應的表面增強拉曼光譜法測定牛奶中三聚氰胺的含量

馮彥婷，林沛純，謝慧風，王玲，李承勇*

1(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江，524088) 2(廣東海洋大學 深圳研究院，廣東 深圳，518018) 3(廣東海洋大學 化學與環境學院，廣東 湛江，524088)

三聚氰胺(2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪，C3H6N6)，俗稱蛋白精、密胺，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物[1-3]。現代醫學研究表明，三聚氰胺會損害腎功能，導致急性腎功能衰竭，甚至死亡[4-6]。由于三聚氰胺的氮含量高(約66.66%)，不少無良商販為了降低生產成本，在牛奶中違法添加三聚氰胺來提高牛奶的氮含量。

迄今為止，常規檢測三聚氰胺的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、離子色譜法、分光光度法和酶聯免疫吸附法(ELISA)等[7-8]。然而，上述方法雖然可以進行準確地定性及定量分析，但是也存在著一些缺點，例如操作條件苛刻(只能在試驗室進行檢測)、處理步驟繁瑣、檢測時間長以及耗材成本高等[9]。因此，開發一種便捷、簡單、快速、經濟地檢測牛奶中三聚氰胺的方法具有重要的應用價值與實際意義。

近年來，表面增強拉曼散射技術由于其靈敏度高和檢測速度快而備受關注[10-11]，一直被認為是化學和生物傳感應用的強大分析技術。目前，已經有許多研究利用SERS技術對三聚氰胺進行快速檢測[12]。使用的SERS活性基底主要有銀溶膠、金/銀納米粒子、高效金納米SERS傳感芯片、以金納米微球組成的空穴金片、以銀-金合金制備的空心納米管等[13]。其中，銀溶膠的制備方法較為簡單，增強活性比金和銅高[14]，是一種常見的基底。有研究表明，含能電離氯離子(Cl-)的水溶液使銀溶膠凝聚，堿性溶液可以促使三聚氰胺與銀溶膠結合，從而大幅度增強SERS信號[15]。趙蕊池等[16]采用多元醇法合成、流體流動法組裝制備的有序納米銀線基底來增強拉曼信號，實現了樣品中痕量三聚氰胺的快速靈敏檢測，檢測限可達0.05 mg /L。但該方法需要將樣品進行干燥處理，延長了檢測時間；同時在樣品溶液蒸發干燥過程中容易出現“咖啡環效應”，導致拉曼信號不穩定。

本文以50 nm的銀納米顆粒為基底，通過研究不同材料的襯底、銀溶膠與樣品的比例、NaCl濃度、NaOH濃度對SERS信號的影響確定最適的拉曼光譜檢測條件。以期實現對牛奶中三聚氰胺的實時、快速檢測，提升檢測效率的同時避免“咖啡環效應”。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒙牛純牛奶、伊利純牛奶、燕塘純牛奶，湛江市霞山區沃爾瑪超市。

AgNO3、三聚氰胺、三氯乙酸、檸檬酸鈉，美國sigma-Aldrich公司；NaCl、NaOH、HCl、H2SO4，廉江市愛廉化試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

超純水一體機(D24-UV)，上海君翼儀器設備有限公司；萬分之一電子天平(JJ124BC)，常熟市雙杰測試儀器廠；臺式高速冷凍離心機(Sigma3K15)，北京科普順科技有限公司；透射電子顯微鏡(JEOL 1400)，日本電子公司；紫外可見分光光度計(U-3900H)，日本日立公司；便攜式拉曼光譜儀、拉曼支架(SR-510 Pro)，美國海洋光學亞洲公司。

1.3 方法

1.3.1 銀溶膠的制備

根據文獻報道的方法[17]：取100 mL質量濃度為0.18 g/L AgNO3溶液于潔凈的玻璃容器中，在120 ℃下緩慢攪拌至沸騰，迅速加入2 mL質量濃度為10 g/L檸檬酸鈉溶液混勻，繼續在沸騰條件下攪拌1 h后反應終止并冷卻至室溫。過0.22 μm水系膜得到均一相的銀溶膠，在4 ℃下避光儲存，備用。

1.3.2 三聚氰胺標準溶液的制備

準確稱取0.1 g三聚氰胺溶解，定容于100 mL容量瓶中。將其稀釋成不同質量濃度(100、10、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.001 mg/L)的三聚氰胺標準溶液，在4 ℃下避光儲存，備用。

1.3.3 樣品的預處理及光譜采集

將15 mL牛奶與10 mL質量濃度為200 g/L三氯乙酸充分混合后加入到50 mL離心管中靜置30 min，使蛋白質沉淀。隨后以8 000 r/min離心5 min，取上清液過濾后備用。

依次取60 μL銀溶膠、60 μL NaCl溶液(4 mol/L)、60 μL NaOH溶液(4 mol/L)和120 μL不同品牌的牛奶于1.5 mL離心管中混勻，取90 μL混合液滴于鈦板的圓柱形凹槽中，迅速采集拉曼光譜。

1.3.4 SERS檢測

使用便攜式拉曼光譜儀收集拉曼光譜，激發波長785 nm；光譜掃描200～3 000 cm-1；探頭工作距離7.5 mm；光斑直徑小于2 mm；積分時間5 s；使用軟件自帶扣除背景信號功能。同時，采用該公司提供的SERS基片專用支架。SERS的測量均采集7次求平均值。除非另有說明，在測量條件的優化中，三聚氰胺的質量濃度為0.1 mg/L。

2 結果與分析

2.1 銀溶膠的表征

本試驗所制備的銀溶膠呈黃綠色，經超純水稀釋10倍后，用紫外可見分光光度計檢測其吸收光譜見圖1-a。從圖1-a中可知，銀溶膠的最大吸收峰位于405 nm，與參考文獻相符[15]。此外，其半峰寬較窄，且未出現雜峰，表明本實驗所制備得到的銀溶膠納米顆粒分散性良好并且粒徑分布均勻[18-19]。

本文使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)對銀溶膠中納米顆粒的形貌和大小進行了表征，如圖1-b所示，大部分銀納米顆粒的直徑約50 nm。向銀溶膠中加入4 mol/L NaCl溶液混勻，顏色由青灰色逐漸轉變為灰色，此時銀納米顆粒開始凝聚，為除去NaCl經15 h的透析處理，取沉淀溶于1 mL超純水，超聲5 min。TEM表征見圖1-c，銀納米顆粒大量聚集，可以產生足夠增強等離子體共振的“熱點”，從而起到很好的放大SERS信號的效果。

a-銀溶膠的紫外-可見吸收光譜；b-銀溶膠的TEM圖片；c-銀溶膠聚集后的TEM圖片

圖1 銀溶膠的表征

Fig.1 Characterization of silver colloid

2.2 三聚氰胺粉末的常規拉曼檢測

如圖2所示，在鈦片上獲得三聚氰胺粉末的常規拉曼光譜。從圖中可知，在374 cm-1、577 cm-1、672 cm-1、777 cm-1、982 cm-1、1 447 cm-1、1 559 cm-1等處出現了三聚氰胺拉曼特征峰。由于三聚氰胺的三嗪環呼吸振動[20]，拉曼峰在672 cm-1時強度最高，本實驗以此處的特征峰作為識別三聚氰胺的指紋峰。

圖2 三聚氰胺粉末的常規拉曼光譜圖

Fig.2 Raman spectra of melamine powder

2.3 SERS襯底材料的選擇

迄今為止，已經報道過多種材料作為SERS襯底，如硅片、載玻片、鋁片等[21-23]。因此，為了比較幾種不同材料的襯底對SERS檢測的效果，本實驗保持其他參數一致，采用不同材料的襯底，采集了三聚氰胺溶液的SERS光譜。

圖3 SERS襯底材料的選擇

Fig.3 SERS substrate material selections

由圖3可知，載玻片作為襯底時，由于背景信號干擾性較強，三聚氰胺的SERS光譜特征峰最弱；又因疏水角小，液滴易展開，導致液滴高度降低，焦點無法聚集在樣品上，SERS的響應也因此下降。硅片在516 cm-1處有一個硅元素的拉曼峰，且在1 500～3 000 cm-1有寬闊的熒光背景，低濃度樣品中會掩蓋三聚氰胺1 558 cm-1處的特征峰。雖然鋁片作為襯底時，得到的SERS光譜特征峰很強，但鑒于NaOH能與鋁片反應，不僅會產生氣泡，而且另一產物偏鋁酸鈉是一種速凝劑，也會影響銀溶膠的凝聚。金屬鈦因其化學性質穩定，且SERS信號較強，故選擇鈦板作為SERS襯底材料。將待測液滴于鈦板的圓柱形凹槽中，來維持液滴的高度，從而得到更穩定的SERS信號。

此外，與三聚氰胺粉末的常規拉曼光譜相比，SERS光譜中三嗪環呼吸振動峰由672 cm-1紅移到699 cm-1，發生了27 cm-1的頻移，C-N-C彎曲振動峰由982 cm-1紅移到1 069 cm-1，發生了87 cm-1的頻移，其他的拉曼峰也發生了不同程度的頻移。這種頻移現象可能是由堿性銀膠的SERS增強效應引起的。

2.4 檢測條件的優化

銀溶膠是一種液態的SERS基底，通常會受到多因素的干擾。因此，在保持三聚氰胺SERS混合液滴高度不變的前提下，依次探究了銀溶膠與樣品的體積比、NaCl濃度及NaOH濃度對三聚氰胺SERS強度的影響。從圖4-a可知，當樣品用量不足時，三聚氰胺所占的比例降低，致使檢測結果不準確；當樣品用量過多時，堿性銀膠不足以提供豐富的熱點，三聚氰胺的SERS信號無法得到充分增強；當銀溶膠與樣品的比例為1∶2時，三聚氰胺SERS光譜上699 cm-1處的SERS信號得到最大增強。圖4-b顯示出三聚氰胺的SERS特征峰強度隨著NaCl濃度的增大而增大，當NaCl濃度超過4 mol/L后，不再有明顯的變化。因此使用NaCl溶液的濃度為4 mol/L。圖4-c表明，拉曼特征峰強度隨著NaOH濃度的增大而增大，但當NaOH濃度超過4 mol/L后，特征峰的強度下降。因此NaOH溶液的最適濃度為4 mol/L。

圖4 銀溶膠與樣品的體積比(a)、NaCl濃度(b)、NaOH 濃度(c)對三聚氰胺SERS光譜強度的影響

Fig.4 The effects of the volume ratio of silver colloid to sample(a) the NaCl concentration (b) and the NaOH concentration (c) on SERS spectra intensity of melamine

2.5 水中靈敏度的評估及SERS增強因子的計算

根據上述優化后的條件，確定了各成分的最佳參數。依次取60 μL銀溶膠、60 μL 4 mol/L NaCl溶液、60 μL 4 mol/L NaOH溶液和120 μL不同濃度三聚氰胺溶液于1.5 mL離心管中混勻，取90 μL混合液滴于鈦板的圓柱形凹槽中，迅速采集拉曼光譜(圖5-a)。從圖中可知，水溶液中三聚氰胺的質量濃度低至0.001 mg/L時，仍可以在SERS光譜上觀察到明顯的特征峰。在0.01～0.5 mg/L，SERS強度隨著三聚氰胺濃度的增大呈對數增強(圖5-b)，得到擬合線性方程y=130 417.384+55 207.529x，線性相關系數R2=0.982。

a-水溶液中不同濃度的三聚氰胺SERS光譜；b-水溶液中三聚氰胺溶液的標準曲線

圖5 三聚氰胺的拉曼線性報告

Fig.5 Raman linear report of melamine concentrations in aqueous solution

為了計算銀溶膠的SERS增強因子(enhancement factor, EF)，本文分別測量了質量濃度103mg/L三聚氰胺溶液的常規拉曼光譜和0.1 mg/L的三聚氰胺溶液的SERS光譜，其積分強度分別為3 895.511 counts和876 614.919 counts，如圖6所示。SERS增強因子的計算如公式(1)所示。

(1)

式中，ISERS、CSERS是SERS光譜中三聚氰胺特征峰的積分強度和相對應的三聚氰胺的濃度；INR、CNR分別是常規拉曼光譜上三聚氰胺特征峰的積分強度和相對應的三聚氰胺的濃度。EF值越大，表明SERS信號增強作用越明顯。由公式(1)計算出銀溶膠的增強因子為2.25×106。

圖6 103 mg/L三聚氰胺溶液常規拉曼光譜和0.1 mg/L三聚氰胺溶液SERS光譜

Fig.6 Normal Raman spectra of 103 mg/L melamine and SERS spectra of 0.1 mg/L melamine

2.6 牛奶中三聚氰胺LOD值評估及實際應用

依次取60 μL銀溶膠、60 μL 4 mol/L NaCl溶液、60 μL 4 mol/L NaOH溶液和120 μL不同濃度三聚氰胺加標牛奶于1.5 mL離心管中混勻，取90 μL混合液滴于鈦板的圓柱形凹槽中，迅速采集拉曼光譜(圖7-a)。由圖可知，在699 cm-1處的拉曼峰值隨著加入三聚氰胺濃度的增大而增大。由此，計算出在質量濃度0.2～10 mg/L牛奶中三聚氰胺的濃度與拉曼強度之間呈線性關系(圖7-b)，即y=173.06x+570.8，R2=0.998。依據公式LOD = 3SD /k計算出利用表面增強拉曼技術能夠檢測到牛奶中三聚氰胺含量的最低濃度為0.08 mg/L,其中SD和k分別是可檢測到最低樣品濃度的標準偏差和校準曲線的斜率。

a-牛奶中不同濃度的三聚氰胺SERS光譜；b-牛奶中三聚氰胺溶液的標準曲線；c-實際樣品的檢測

圖7 牛奶中三聚氰胺的SERS檢測

Fig.7 SERS detection of melamine in milk

本文檢測了3種常見市售純牛奶的三聚氰胺含量，其SERS光譜如圖7-c所示。3種市售純牛奶的SERS光譜除了在609、699、865、903、1 426 cm-1等處出現明顯的拉曼峰，在701 cm-1處同樣有較低的拉曼峰，這些拉曼峰來源于牛奶中的其他成分[24]。在1 mg/L三聚氰胺加標牛奶的SERS光譜中，699 cm-1處的拉曼特征峰的強度比未加標的3種純牛奶高。依據《公告》規定[25]，嬰兒配方食品中三聚氰胺含量不得超過1 mg/L，其他食品中不得超過2.5 mg/L。且根據線性方程計算得出3種市售牛奶三聚氰胺含量均未超標。

2.7 重復性與穩定性的研究

信號不穩定在拉曼檢測中是一種常見的現象，這是由于制作SERS基底過程中納米顆粒分布不均勻造成的。而重現性又影響到體系檢測的效率，為研究本方法的重現性，將1 mg/L加標牛奶平行測量20次，統計拉曼光譜如圖8-a所示。在699 cm-1處的拉曼峰值相對標準偏差(RSD)為4.34%，表明在該基底下牛奶中三聚氰胺的拉曼信號具有良好的重現性。將銀溶膠放置在4 ℃下保存11個月后進行超聲處理，對同一批次的加標牛奶測量20次拉曼強度(圖8-b)，計算出RSD=6.28%。由此證明該方法具有良好的重現性和穩定性。

a-1mg/L加標牛奶的SERS光譜；b-放置11個月基底測量1mg/L加標牛奶的SERS光譜

圖8 SERS光譜的重復性與穩定性

Fig.8 The repeatability and stability of melamine SERS spectra

3 結論

本研究所制備的銀溶膠中大部分銀納米顆粒的直徑約50 nm，顆粒分散性好，在聚集后產生的“熱點”可使SERS增強因子達到2.25×106。通過測量方案的優化，確定了實驗條件中各成分的最佳參數。在0.01～0.5 mg/L，測試了不同濃度三聚氰胺水溶液在699 cm-1處的SERS光譜，其擬合線性方程y=130 417.384+55 207.529x，R2=0.982。在0.2～10 mg/L，SERS強度隨著牛奶中三聚氰胺濃度的增大而增強，擬合線性方程y=173.06x+570.8，線性相關系數R2=0.998。此外，計算出該方法的檢測限為0.08 mg/L。與1 mg/L三聚氰胺加標牛奶相比，燕塘、伊利以及蒙牛純牛奶中三聚氰胺含量均未超標，此法可以用于牛奶中三聚氰胺含量的快速檢測。在重復測量20次1 mg/L加標牛奶后得出相對標準偏差為4.34%，證明了該方法具有良好的穩定性。