種苗根熒光反應在多年生黑麥草與一年生黑麥草兩個種測定中可靠性驗證

楊瀟逸 郭雪燕 孫 彥

（中國農業大學草業科學與技術學院/農業農村部牧草與草坪草種子質量測試中心（北京），北京 100193）

黑麥草不僅是重要的牧草，同時在草坪上也廣泛應用，主要有一年生黑麥草（Lolium multiflorum Lam.）和多年生黑麥草（Lolium perenne L.）兩個種最為常用。一年生和多年生黑麥草兩個草種在植株形態上有一定的差異，一般來說，一年生黑麥草植株株高較高，葉較寬；穗長，小穗多，小穗含花較多；穎片短，稃長，外稃具有芒，而多年生黑麥草外稃無芒；與多年生黑麥草相比，一年生黑麥草幼苗具有較強活力；一年生黑麥草幼葉為卷包式，多年生黑麥草為折疊式。

一年生黑麥草與多年生黑麥草的商業種子非常相似，很難用肉眼鑒別，雖然說一年生黑麥草種子有芒，而多年生黑麥草種子無芒，但是由于在收獲和加工過程中種子芒容易脫落，這給種子的鑒定帶來困難。由于價格上的差異，混雜后，對草種子的銷售與使用等帶來不必要的影響。所以如何區別一年生黑麥草與多年生黑麥草種子，防止商業銷售種的混雜尤為重要。

植株鑒定方法需要時間長，往往在急需了解草種情況下無法滿足需求，所以種苗根的熒光反應（SRF，Seedling Root Fluorescence）自1928 年Gentner[1]發現以來，已作為國際和國內的標準方法被用于一年生黑麥草和多年生黑麥草草種的鑒定[2-6]，此方法需時相對短，操作簡單。通常情況下，發芽試驗中濾紙上生長的一年生黑麥草的幼苗根分泌生物堿annuloline[7]，在紫外線下發出熒光，多年生黑麥草幼苗不分泌生物堿因此無熒光反應。然而，有研究表明存在有熒光多年生黑麥草和無熒光一年生黑麥草[3，8-11]。本試驗旨在探究種苗根熒光測定對黑麥草種間鑒定的可靠性，以確保種子檢驗的正確與準確性。

1 材料與方法

1.1 材料本試驗所用種子由中國農業大學牧草種子實驗室提供，包括4 個一年生黑麥草品種（安格斯1 號、伯樂、牧謠、邦德）及4 個多年生黑麥草品種（天使、東景、綠神、大莊園）。采用直徑12cm濾紙，直徑12cm 培養皿；LRH-250-G Ⅱ光照培養箱（廣東省醫療器械廠）；紫外儀（北京六一儀器廠）；花盆；Pindstrup substrate 營養土。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌發從一年生黑麥草各品種經過充分混合的種子中，取有明顯芒的種子150 粒。從多年生黑麥草各品種經過充分混合的種子中，隨機取150 粒種子。以50 粒作為一個重復，每個品種設置3 個重復。培養皿中放置3 層濾紙，并用預冷的KNO3潤濕，避免濾紙與培養皿之間產生氣泡。將種子均勻地分布在濕潤的發芽床上，每粒種子間保持適當的距離，以減少相鄰種子對幼苗發育的影響，并且能減少后續紫外觀察種苗根的熒光的互相干擾。胚芽朝上，胚根朝下，方向一致，并留出1/3 的空白方便培養時添水。

蓋上培養皿蓋，用橡皮筋固定，傾斜置于5～10℃下預冷7d，解除種子的休眠。之后轉移到培養箱（12h黑暗20℃，8h 光照30℃）中進行萌發，生長2 周待根4～6cm 時進行熒光鑒定。萌發期間經常檢查水分、溫度和通氣狀況，及時補充蒸餾水保持濕潤。

1.2.2 熒光鑒定 將發芽后的種子置于紫外線檢測器下用302nm 紫外光照射，分別計數各材料根的熒光強度，用強、弱、無表示。

發芽率=X/150×100%，X 為發芽種子數。

熒光率=（X-Z）/X×100%，Z 為正常發芽但不發光的種子。

1.2.3 種鑒定依據將種苗根熒光檢驗過的幼苗從濾紙上取下，并按照熒光強度分類移栽到花盆中培養，置于溫室。一年生黑麥草共550 株熒光苗和1 株無熒光苗移栽置花盆，多年生黑麥草共23 株熒光苗和539 株無熒光苗移栽置花盆。花盆基質為蛭石∶營養土=1∶2。培養一段時間后，通過植株形態的觀察，以幼葉卷疊方式來鑒定黑麥草的種類：卷包式為一年生黑麥草，折疊式為多年生黑麥草。

2 結果與分析

2.1 熒光測定統計分析利用上述方法，對多年生黑麥草以及一年生黑麥草各品種進行了熒光檢驗，結果見表1。由試驗結果可得知，除伯樂外一年生黑麥草熒光率均為100%，伯樂的熒光率為99.26%，無熒光率為0.74%；各品種多年生黑麥草均有少量熒光，熒光率隨品種而有所差異，本試驗測定的4 個品種中熒光率在2.13%～7.97%之間波動。從本試驗可看出存在有熒光多年生黑麥草及無熒光一年生黑麥草。

表1 兩種黑麥草草種的熒光檢驗結果

2.2 植株鑒定驗證熒光反應將發芽的黑麥草幼苗根據不同的熒光情況從培養皿分別移入盆栽培養一段時間后，通過植株形態觀察，以幼葉卷疊方式來鑒定兩種黑麥草。由表2 得知，樣品中一年生黑麥草幼葉全部為卷包式幼葉，說明樣品全部為一年生黑麥草；而多年生黑麥草中出現兩個卷包式的幼葉（冬景1 個，綠神1 個），說明多年生黑麥草中摻雜少量一年生黑麥草種子。多年生黑麥草（折疊式幼葉）具熒光反應的種子數總共為19 個，其中強熒光種子數11 個（分別為冬景2 個、大莊園4 個、天使5 個），而弱熒光種子數8 個（大莊園2 個、綠神1 個、天使5 個）；一年生黑麥草（卷包式幼葉）的無熒光種子數為1（伯樂1 個）。由此進一步證實了存在一年生無熒光的黑麥草，也存在多年生有熒光的黑麥草。

表2 兩種黑麥草形態學檢驗結果

3 結論與討論

國際上從1940 年開始采用種苗根的熒光反應方法進行黑麥草的種間鑒定，并被國際種子檢驗協會（ISTA）認可[5]。我國2017 年發布的國標《草種子檢驗規程》也采用的是黑麥草屬熒光測定[6]。基于前人的研究結果和本試驗觀察到的現象，可以認為一年生和多年生黑麥草種苗根中都有可能出現熒光。種苗根的熒光測定方法不能作為區分一年生與多年生黑麥草種子的唯一指標，已成為國際社會的共識[3，4，9，12，13]，而國內卻鮮見報道。

通過本試驗得出一年生黑麥草熒光率除伯樂為99.26%以外，其余3 種均為100%，多年生黑麥草熒光率2.13%～7.97%。綜合上述分析，認為黑麥草種苗根的熒光存在一定數量的與典型特征相悖的情況，在不同品種中這一值有所不同，種苗根熒光測定可以作為測定一年生和多年生黑麥草的參考，而不能作為其種及品種鑒定的唯一指標。