設施農業土壤中聚磷菌的篩選及其生物學特性分析

吳曉青，呂玉平，周方園，趙曉燕，張廣志，任 何，周紅姿，王加寧，張新建*

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）生態研究所，山東省應用微生物重點實驗室，濟南 250103；2.中國科學院上海植物逆境生物學研究中心，上海 201600；3.山東新時代藥業有限公司，山東 臨沂 273400）

磷素是植物生長中不可缺少的大量營養元素之一，磷素肥料也是農業生產中最普遍使用的肥料種類之一。為了適應市場需求，近年來我國設施農業產業發展迅速。2015年我國設施農業蔬菜產量已占蔬菜總產量的54%以上，面積、產量和產值都在不斷擴大[1]。在設施農業生產中，盲目大量施用磷肥的現象十分嚴重，磷肥施用量是蔬菜需肥量的5～20倍[2-3]，長期超量使用磷肥不僅在0～20 cm耕層中富集大量的磷，20～40 cm深層土壤中磷素積累量也在不斷增加[3]。不同含磷量土壤的滲漏液中可溶性磷濃度在0.5～5 mg·L-1之間[4]，通過滲漏液流失的磷素易造成毗鄰水體富營養化[5]，是農業面源污染的重要源頭之一[6]，亟需進行除磷處理。目前除磷技術主要包括材料吸附法和生物除磷法。其中吸附法是通過添加礦物、聚合物、生物炭等材料，利用不同材料的吸附或改變無機磷形態的作用，達到除磷效果[7]。而利用聚磷菌（Phosphate accumulating organisms，PAOs）等微生物好氧聚磷、無氧放磷特性的生物除磷技術已經在污水治理方面日趨成熟[8-9]。聚磷菌聚磷與編碼多聚磷酸鹽激酶（PPK）的ppk基因直接相關，其表達的PPK可催化ATP上的磷酸基因連接形成多聚磷酸鹽顆粒（Poly-P）[10]。一些聚磷菌從土壤中分離獲得，例如從磷化工廠周邊土壤中分離的嗜麥芽寡營養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）[11]，從玉米根際土壤中分離的阿氏芽孢桿菌（Bucillus aryabhattai）[12]，從煙草秸稈處理廠土壤中分離的嗜線蟲沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）[13]等。目前，從土壤中分離的聚磷菌主要應用于水體或污泥磷污染的處理，近期研究逐漸關注土壤聚磷菌對土壤磷素的調控作用。設施農業生產中盲目施肥導致過量的磷素滲漏污染地下水，亟需研發土壤磷素調控技術，但目前鮮見設施農業環境中聚磷菌的篩選。為了開發適用于設施農業環境的生物除磷技術，本研究對設施蔬菜大棚土壤中的聚磷菌進行了分離篩選和鑒定，并測定了菌株的環境適應特性和對病原菌的拮抗能力。本研究獲得的不同生物學特性的聚磷菌為進一步開發設施農業生物除磷技術提供了優良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土壤樣品采集自山東蘭陵設施蔬菜大棚（117°57′12″E，34°52′44″N），采樣時間為2017年9月，采樣深度為40 cm以內，土壤類型為褐土，pH 7.0～8.5。

1.2 聚磷菌的篩選

將土壤樣品梯度稀釋后涂布于PAOs平板進行聚磷菌的初步篩選[14]。用無菌水將土壤分別稀釋至10-1、10-2、10-3，振蕩 30 min后靜置30 min獲得上清，即為梯度稀釋液。分別吸取3個梯度稀釋液1 mL置于9 cm培養皿中，與40℃左右的PAOs固體培養基[含檸檬酸鈉 4 g、NaCl 0.5 g、（NH4）2SO42.5 g、CaCl20.25 g、MgSO40.25 g、Na2HPO412.8 g、KH2PO43 g、麥芽糖 0.01 g、甲苯胺藍 0.025 g、瓊脂 20 g，無需調節pH，115℃滅菌30 min]充分混合凝固，在28℃恒溫培養箱中暗培養7～10 d。在PAOs平板上長出的菌落中挑選著色為紫紅色的菌落，反復劃線分離，直至平板上的單菌落形態一致，顯微鏡下大小形態也一致，即為初篩菌株。

采用異染粒染色法[15]對初篩菌株進行復篩。在載玻片上涂布菌液，首先置于染色液Ⅰ（甲苯胺藍0.15 g和孔雀綠0.2 g溶于2 mL乙醇，再加入混合均勻的1 mL冰醋酸和100 mL蒸餾水）中染色5 min，再用染色液Ⅱ（碘2 g和碘化鉀3 g，共同溶于100 mL蒸餾水）沖去染色液Ⅰ，繼續染色1 min，在顯微鏡下鏡檢，其中異染粒被染成紫黑色，菌體為綠色。

1.3 菌體磷含量和除磷率的測定

挑選純化后的單菌落接入到LB（含胰蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1）培養液中，30℃、180 r·min-1振蕩暗培養過夜，活化菌株。將菌株發酵液以體積比1∶100加入到低營養檢測培養液[16][含 MgSO4·7H2O 0.4 g、FeSO4·7H2O 0.002 g、CaSO4·2H2O 0.08 g、CH3COONa 0.5 g、牛肉膏 0.22 g、（NH4）2SO40.2 g、KH2PO443.87 mg、dd′H2O 1 L，用1.0 mol·L-1的NaOH調節pH至6.5]中，初始總磷質量濃度為10 mg·L-1，30 ℃、180 r·min-1振蕩暗培養至對數期，以未接菌株的低營養培養液為對照。參考蔡天明等[17]方法，以過硫酸鉀消解菌體，按照總磷測定方法測菌體總磷量：

菌體磷含量=菌體總磷量/菌體干質量×100%。

將獲得的培養物 5000 r·min-1離心 10 min，取上清測定磷含量，計算除磷率：

除磷率=（對照總磷量-上清液總磷量）/對照總磷量×100%。

上述實驗均設置3個生物學重復。采用鉬銻抗比色法[14]測定磷含量。測定5個濃度（1、3、5、10、20 mg·L-1）磷標準液的吸光度，通過繪制標準曲線獲得磷濃度和吸光度關系公式（圖1），利用關系式計算待測液中的磷含量。

圖1 磷濃度測定的標準曲線Figure 1 Standard curve for determination of phosphorus concentration

1.4 菌株種屬的分子鑒定

菌株活化后（同1.3），將菌液寄送至青島擎科公司進行測序，測序基因為16S rRNA，引物分別為1492 R和27 F[18]。將基因測序結果在Genbank中BLAST比對，采用MEGA-X對16S rRNA結果進行比對分析，采用Maximum Likelihood法繪制系統發育樹。

1.5 多聚磷酸鹽激酶基因（ppk）的PCR驗證

針對兩株節桿菌Fp64和Fp38，參考Genbank中節桿菌屬ppk基因序列，利用Bioedit軟件分析保守區，設計引物并進行PCR擴增。微桿菌Np20和紅球菌Fp31分別參考Genbank中同種序列，設計引物進行PCR擴增。引物設計軟件為Primer Premier 6.0，引物序列詳見表1。PCR反應體系包括：2×Taq PCR Colorless Mix（鼎國）25L，DNA模板0.5L，primer（10mol·L-1）各2L，dd′H2O 20.5L。PCR擴增條件：94℃ 5 min，94℃ 45 s、55℃或50℃ 45 s、72℃ 1 min 20 s，32個循環，72℃10 min。PCR產物寄送至上海生工測序后，利用Bioedit軟件進行序列同源性比對。

表1 ppk基因的引物信息Table 1 Primer information of ppk genes

1.6 菌株的耐鹽效果測定

菌株活化后（同1.3），將濃度統一調整至1×109CFU·mL-1，以體積比1∶100分別接種至NaCl終濃度為 50、100、150 g·L-1的 LB培養液中，30 ℃、180 r·min-1暗培養振蕩28 h，以不添加NaCl的LB培養液為對照。從不同處理中分別取100L培養物，均勻涂布在LB固體（含胰蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、瓊脂15 g·L-1）培養平板上，在30 ℃恒溫培養箱中暗培養48 h，統計單菌落數，計算耐鹽率，本試驗設3個生物學重復。計算公式：

耐鹽率=處理菌數/對照菌數×100%。

1.7 菌株的耐高溫效果測定

菌株活化后（同1.3），將濃度統一調整至1×109CFU·mL-1，以體積比1∶100接種至LB培養液中，分別在40℃和50℃下，180 r·min-1暗培養振蕩28 h，以30℃培養條件為對照。從不同處理中分別取100L培養物，均勻涂布在LB固體培養平板上，在30℃恒溫培養箱中暗培養48 h，統計單菌落數，計算耐高溫率，本試驗設3個生物學重復。計算公式：

不同溫度下耐高溫率=處理菌數/對照菌數×100%。

1.8 菌株對病害的拮抗效果測定

菌株活化后（同1.3），將濃度統一調整至1×109CFU·mL-1，取200L菌液至9 cm培養皿中，與40℃左右的PDA（BD，America）固體培養基充分混勻凝固。分別在培養平板中央接入直徑為5 mm的病原菌菌塊，分別為從病株分離的灰霉菌（Botrytis spp.）、腐霉菌（Pythium spp.）、立枯絲核菌（Rhizoctonia spp.）和鐮刀菌（Fusarium spp.），對照為各病原菌在PDA平板上單獨培養。將上述平板置于25℃培養3～4 d，統計病原菌菌落直徑，計算拮抗率，本試驗設3個生物學重復。計算公式：

對不同病原菌的拮抗率=（對照直徑-處理直徑）/對照直徑×100%

1.9 統計學分析方法

采用Excel 2016軟件進行數據統計分析。采用SPSS 22.0軟件，用Duncan法進行多組樣本間差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 設施土壤聚磷菌的篩選

將采集自設施蔬菜大棚的土壤樣品，通過PAOs平板篩選獲得初篩單菌落，再根據其菌落、革蘭氏染色等形態特征初步分為17類細菌。對篩選獲得的17類細菌進行異染粒染色，顯微鏡檢具有明顯異染粒結構的菌株。復篩獲得7株細菌（分別命名為Fp64、Fp31、Np20、Fp38、Bp13、Bp14和Bp12），均為革蘭氏陽性菌并可觀察到異染粒結構。圖2所示為代表菌株Fp64的革蘭氏染色和異染粒染色情況。

圖2 菌株Fp64的形態學觀察Figure 2 Morphological observation of the strain Fp64

PCR擴增篩選菌株的16S rRNA后測序，并在Genbank中進行Blast比對，結果表明上述7株菌分別屬于節桿菌（Arthrobacter spp.）、芽孢桿菌（Bacillus spp.）、紅球菌（Rhodococcus spp.）和微桿菌（Microbacterium spp.）4個屬的6個不同種，系統發育樹如圖3所示。經Bioedit軟件進行序列同源性比對分析，Fp64與A.ureafaciens FN433020.1的16S rRNA同源性為98.8%，Fp38與A.keyseri JF703649.1的同源性為100%，Bp12和Bp13與B.subtilis MF196314.1的同源性分別為99.0%和97.1%，Bp14與B.methlotrophicus KC172004.1的同源性為99.0%，Fp31與R.rhodochrous KP-25713.1的同源性為99.9%，以及Np20與M.esteraromaticum JN082268.1的同源性為100%。

2.2 聚磷菌的除磷作用分析

利用鉬銻抗比色法檢測了上述7株聚磷菌的除磷作用。結果表明，培養至對數期時，除磷率最高的菌株為節桿菌Fp64（70.52%），其次高于50%的依次為紅球菌Fp31（64.34%）、微桿菌Np20（61.39%）和節桿菌 Fp38（56.30%），3株芽孢桿菌 Bp13、Bp14和Bp12的除磷率均低于50%（圖4A）?？梢钥闯觯诤醚鯒l件下，篩選獲得的聚磷菌均有除磷效果，其中節桿菌、紅球菌和微桿菌菌株的除磷率比芽孢桿菌菌株的高。另檢測了對數期菌體中的磷含量（磷占菌體干質量的百分比）。結果表明，Fp31的菌體磷含量最高為18.74%，另外Fp64、Np20和Fp38的菌體磷含量分別為17.89%、15.87%和13.69%，均高于10%，其余Bp14、Bp13和Bp12的菌體磷含量均低于10%（圖4 B）。上述結果表明所篩選聚磷菌中，節桿菌、紅球菌和微桿菌的聚磷效果和除磷作用顯著高于芽孢桿菌。

圖3 菌株系統發育樹Figure 3 Phylogenic tree of screened strains

對篩選獲得的除磷率在50%以上的4株菌Fp64、Fp31、Np20和Fp38進行了ppk基因的PCR驗證（圖5）和DNA測序。本研究篩選的節桿菌A.ureafaciens Fp64和A.keyseri Fp38兩個種在Genbank中沒有ppk基因登記，通過比對同屬ppk基因保守序列，設計引物，PCR擴增獲得的序列與Arthrobacter sp.ATCC21022的ppk基因同源性分別為99.30%和99.20%。根據同種已登記的ppk基因設計引物，PCR擴增獲得的Np20序列與M.esteraromaticum DSM8609的ppk基因同源性為99.70%，Fp31序列與R.rhodochrous NCTC630的ppk基因同源性為99.50%。結果表明，本研究篩選的聚磷菌基因組中均具有可催化產生Poly-P的ppk基因，從基因水平驗證了4株菌的聚磷作用。

圖4 聚磷菌的除磷效果分析Figure 4 Phosphorus removal efficiencies of the screened PAOs

圖5 4株聚磷菌ppk基因片段的PCR產物Figure 5 PCR product of ppk gene fragment of 4 strains

2.3 聚磷菌的其他特性分析

許多設施農業生產中存在積鹽、高溫和病害高發等不良生長條件，為了檢測所篩選菌株在應用中的環境適應性，分別對其中除磷率大于50%的4株菌Fp64、Fp31、Np20和Fp38的耐鹽、耐高溫和對常見病原菌的拮抗能力進行了分析。

結果表明，4株菌均具有一定的耐鹽性，但水平高低不同。其中紅球菌Fp31的耐鹽能力最為顯著，在50 g·L-1和100 g·L-1的NaCl條件下其生長不僅未被脅迫，反而菌數大幅提高（分別提高到4.88倍和3.07倍），在鹽濃度高達150 g·L-1時，菌數仍可達對照的42.03%，其他3株菌則被嚴重抑制。兩株節桿菌Fp64和Fp38在50 g·L-1NaCl條件下菌數未受顯著影響，Fp64還可耐受100 g·L-1鹽濃度，但同樣濃度下Fp38的菌數僅為對照的69.69%。微桿菌Np20的耐鹽水平較差，在50 g·L-1鹽脅迫下菌數已降至對照的59.10%（圖6A）。

在50℃高溫條件下，4株菌的生長均受到抑制，其中微桿菌Np20和紅球菌Fp31的耐受性較好，分別為44.15%和32.04%，而兩株節桿菌Fp64和Fp31幾乎被高溫完全抑制（圖6B）。

兩株節桿菌Fp64和Fp31對4種病原真菌均具有較強的抑制作用，其中對腐霉菌均可100%抑制，對鐮刀菌的抑菌率分別為86.99%和78.57%，對灰霉菌和立枯絲核菌的抑菌率也在50%～70%。微桿菌Np20也可完全抑制腐霉菌生長，對鐮刀菌和灰霉菌的抑制率在60%以上，但對立枯絲核菌的抑制率低于10%。紅球菌Fp31對4種病原真菌的抑制能力較差，對腐霉菌無抑制作用，對其他病原菌的抑制率均在20%以下（圖6C）。結果表明，4株聚磷菌具有不同的生物學特性，其中紅球菌的耐鹽性較強，兩株節桿菌的病原菌拮抗性、耐鹽性較好，微桿菌比較耐高溫。

3 討論

圖6 聚磷菌的生物特性檢測Figure 6 Biological characters of PAO strains

本研究對設施蔬菜大棚土壤中的聚磷菌進行了分離、篩選和鑒定，共獲得屬于節桿菌、紅球菌、微桿菌和芽孢桿菌4個屬的7株菌。劉菡[9]從東北玉米主產區的黑土、白漿土和黑鈣土中分離得到的聚磷菌除了節桿菌、芽孢桿菌屬外，還有不動桿菌（Acinetobacter spp.）、氣單胞菌（Aeromonas spp.）、棒桿菌（Corynebacterium spp.）等10個屬的細菌以及少數放線菌和真菌。Li等[19]從玉米根際土中分離得到的高效聚磷菌PA09經鑒定為煙草節桿菌（A.nicotinanae）。另外費氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）[17]和嗜線蟲沙雷氏菌（Serratianem atodiphila）[13]也是自土壤中分離得到的高效聚磷菌。閆海嘯等[20]發現農田黑土中具有除磷功能的細菌種屬顯著高于污水處理廠活性污泥中篩選的聚磷菌。上述研究表明，不同類型的土壤中定殖著各種具有除磷功能的聚磷菌，本研究從設施蔬菜土壤中篩選獲得的節桿菌、紅球菌和微桿菌的除磷效果較好，其中紅球菌和微桿菌是首次從土壤中篩選得到的被證明有除磷作用的聚磷菌。無論從水體污泥還是土壤中獲得的聚磷菌，大部分用于外部水體磷污染的治理[8，21-24]，而鮮見針對設施農業土壤環境進行的聚磷菌篩選，本研究從設施大棚土壤中篩選聚磷菌，可利用其好氧攝磷的特性將磷固定在菌體中。初始總磷濃度為10 mg·L-1，時最高可去除70.52%的磷，共有4株菌高于50%，而土壤滲漏液中的可溶性磷一般在10 mg·L-1以下[4]。據相關報道，高磷濃度下篩選獲得的聚磷菌可充分滿足較低濃度磷污染的修復[25-26]，故而本研究所篩選菌株可滿足土壤滲漏液除磷。所篩選聚磷菌的菌體含磷量最高為18.74%，共有4株菌高于10%，參考前人研究[17]，所篩菌株的聚磷能力較強。其中節桿菌Fp64的菌體含磷量略低于紅球菌Fp31，但同樣在對數期時，前者的除磷效果卻顯著高于后者。由于菌體含磷量與菌體質量負相關，而除磷率與菌數正相關。因此，在單菌細胞吸收磷素水平差異較小時，可能出現菌體含磷量較低但除磷率較高的情況。另外，本文通過PCR驗證了4株聚磷菌中均存在ppk基因，但該基因在聚磷作用中的表達水平未經驗證，需要進一步揭示其作用機制。

為了解所篩選的聚磷菌對設施農業環境的適應性，本研究還考察了聚磷菌的耐高溫、耐鹽和對病原菌的抑制率，結果表明不同屬的聚磷菌呈現不同的生物學特性。其中兩株節桿菌Fp64和Fp38對真菌病原菌均具有高效抑制作用，并可耐受100 g·L-1的鹽濃度，前人研究中節桿菌屬菌株具有病原菌拮抗作用[27-30]，也具有耐鹽特性[31]。另有研究表明產脲節桿菌（A.ureafaciens）還具有對一種毒性農藥阿特拉津的降解作用[32-33]，因此節桿菌在設施農業中具有多功能的應用潛力。除了節桿菌之外，本研究中微桿菌Np20對病原菌也具有一定的拮抗作用，且耐高溫性較好，而紅球菌Fp31較耐高溫、對病原菌拮抗作用不明顯，但具有顯著耐鹽性。另外，節桿菌、微桿菌、紅球菌和芽孢桿菌屬均曾報道為促生植物生長根際細菌（PGPR）[34-35]，本文中聚磷菌是否兼具促生作用還有待進一步驗證。在接下來的研究中，我們將分析各菌株在土壤中施用后調節土壤滲漏液磷含量的效應，以及控制磷流失的能力，并利用其生物特性優勢，針對不同土壤環境條件配伍復合菌劑。

4 結論

（1）本研究從設施蔬菜大棚土壤中篩選出7株聚磷菌，經鑒定屬于節桿菌、微桿菌、紅球菌和芽孢桿菌4個屬。

（2）好氧條件下，所有菌株均具有除磷作用，其中Fp64的除磷效果最顯著（70.52%），Fp31的菌體含磷量最高（18.74%）。在除磷率＞50%的4株聚磷菌中，均可擴增出ppk基因。

（3）所篩選的聚磷菌兼具多種其他生物學特性，其中Fp64和Fp38具有病原菌拮抗和耐鹽性，Np20具有病原菌拮抗和耐高溫性，Fp31具有極其顯著的耐鹽性。

（4）本研究所篩選的菌株具有較高的除磷能力和菌體含磷量，兼具拮抗病原菌和良好環境適應性等特點，有望用于控制土壤滲漏液磷流失，為進一步研發針對設施農業土壤環境的高效生物除磷技術提供了優良菌種。