響應(yīng)面法優(yōu)化餐廚垃圾和牛糞混合兩相厭氧發(fā)酵酸化條件

劉金力，洪秀杰，白 巖，畢少杰，楊宏志，王彥杰*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點實驗室，黑龍江 大慶 163411；2.大慶市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，黑龍江 大慶 163411；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

牛糞是常用的厭氧發(fā)酵原料，雖然其在厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)氣穩(wěn)定、對外界的環(huán)境緩沖能力強，但在單獨的牛糞厭氧發(fā)酵體系中，微量元素和營養(yǎng)物質(zhì)是有限的，難以為微生物生長活動提供均衡的營養(yǎng)[1]，并且牛糞單獨厭氧發(fā)酵周期長，這也限制了它的實際應(yīng)用。餐廚垃圾的油脂、有機質(zhì)和易降解的碳水化合物含量高，營養(yǎng)元素不均衡，其在厭氧發(fā)酵過程中易酸化。因此對牛糞和餐廚垃圾進行混合發(fā)酵以使其能夠穩(wěn)定高效地產(chǎn)氣。

混合厭氧發(fā)酵技術(shù)是將兩種及以上的有機原料進行同步消化，可以克服單一原料厭氧發(fā)酵的不足，增加甲烷產(chǎn)量，均衡體系中的營養(yǎng)成分，調(diào)節(jié)含水率[2]。一般認為，適宜厭氧微生物生長的C/N在20左右[3]，牛糞C/N高于此值，并且緩沖pH能力強，而餐廚垃圾的C/N較低。已有研究將餐廚垃圾與牛糞進行混合厭氧發(fā)酵，發(fā)酵系統(tǒng)的緩沖能力得到增強，穩(wěn)定性得到提高，取得了良好的產(chǎn)氣效果[4-5]。厭氧發(fā)酵主要分為4個階段：水解階段、酸化階段、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段和產(chǎn)甲烷階段。在牛糞和餐廚垃圾混合厭氧發(fā)酵過程中水解酸化是厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的限速步驟[6-8]。酸化處理過程中溫度的改變，將影響系統(tǒng)中微生物的生長和代謝，改變酸化產(chǎn)物組成和含量，導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量的差異[9-10]；時間的長短，影響著料液中VFAs的積累量和組成[11]。在單相厭氧消化系統(tǒng)中上述4個階段反應(yīng)同在一個反應(yīng)器進行，而相對于傳統(tǒng)單相厭氧消化，兩相厭氧消化反應(yīng)系統(tǒng)能為產(chǎn)酸相中產(chǎn)酸菌和產(chǎn)甲烷相中產(chǎn)甲烷菌提供其各自所需要的最佳生長條件。

響應(yīng)面法可以在特定區(qū)間內(nèi)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)和響應(yīng)值，已廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)條件和工藝條件的優(yōu)化[12-13]。本試驗以餐廚垃圾和牛糞為混合原料，研究酸化處理條件對兩相厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取酸化時間、酸化濃度和酸化溫度3個因素，利用中心組合設(shè)計試驗，運用響應(yīng)面分析法優(yōu)化酸化處理條件，以期提高餐廚垃圾和牛糞混合物的甲烷產(chǎn)量，為其工程應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗原料為牛糞和餐廚垃圾的混合物，牛糞和餐廚垃圾的比值為2∶1，其比值為揮發(fā)性固體干質(zhì)量比。供試餐廚垃圾取自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)單位食堂，主要包括米飯、面食、蔬菜、肉類等學(xué)校食堂就餐后的剩余物，取回后用JJ-2B粉碎機（金壇市盛威試驗儀器廠）機械打漿2 min。牛糞取自黑龍江省肇東市宋站鎮(zhèn)奶牛養(yǎng)殖場新鮮牛糞。原料收集后均在-20℃條件下保存，使用前在4℃條件下解凍24 h。本實驗室采用半連續(xù)發(fā)酵的方式通過添加餐廚垃圾馴化牛糞料液，將產(chǎn)氣與pH穩(wěn)定的料液經(jīng)自然沉降，所得的上清液作為接種物[14]。餐廚垃圾和牛糞的主要特性見表1。

表1 餐廚垃圾和牛糞的特性Table 1 The characteristics of food waste and dairy manure

1.2 試驗裝置

試驗采用的酸化裝置為1 L的螺口瓶，攪拌前安裝攪拌器進行攪拌（圖1）。發(fā)酵裝置（圖2）為拆除攪拌裝置后的酸化裝置，用硅膠塞密封，料液的裝量為0.8 L。瓶塞上設(shè)有取樣口和集氣口，用1 L的鋁箔集氣袋收集產(chǎn)生的沼氣。

圖1 酸化裝置Figure 1 Acidification apparatus

圖2 發(fā)酵裝置Figure 2 Fermentation apparatus

1.3 單因素試驗設(shè)計

試驗采用批式厭氧消化方法，每個處理4次重復(fù)。將混合料液添加到酸化裝置中，經(jīng)酸化預(yù)處理后，添加接種物240 mL，稀釋料液的濃度至6%，后通入氮氣5 min，使其形成厭氧環(huán)境。在35℃條件下厭氧發(fā)酵30 d。通過測定產(chǎn)氣量和甲烷含量，計算甲烷產(chǎn)率，確定最佳的酸化條件。

在料液濃度為12%、攪拌轉(zhuǎn)速為100 r·min-1（2 min·次-1）條件下，分別設(shè)定攪拌頻率為0、1、2、3、4次·d-1，35℃條件下酸化處理12 h后，稀釋料液濃度至6%，厭氧發(fā)酵30 d，測定甲烷產(chǎn)率，確定最佳的酸化攪拌頻率。

在料液濃度為12%、攪拌頻率為4次·d-1（2 min·次-1）條件下，分別設(shè)定攪拌速率為 0、50、100、150、200 r·min-1，35 ℃條件下酸化處理12 h，稀釋料液濃度至6%，厭氧發(fā)酵30 d，測定甲烷產(chǎn)率，確定最佳的酸化攪拌速率。

在料液濃度為12%、攪拌頻率為4次·d-1（2 min·次-1、100 r·min-1）條件下，分別設(shè)定酸化溫度為15、25、35、45、55 ℃，酸化處理12 h后，稀釋料液濃度至6%，厭氧發(fā)酵30 d，測定甲烷產(chǎn)率，確定最佳的酸化溫度。

設(shè)定料液濃度為8%、10%、12%、14%和16%，在攪拌頻率為4次·d-1（2 min·次-1、100 r·min-1），35℃條件下酸化處理12 h后，稀釋料液濃度至6%，厭氧發(fā)酵30 d，測定甲烷產(chǎn)率，確定最佳的酸化濃度。

在料液濃度為12%、攪拌轉(zhuǎn)速為4次·d-1（2 min·次-1、100 r·min-1）條件下，分別設(shè)定酸化時間為0、4、8、12、16、20、24 h，35 ℃條件下進行酸化處理后，稀釋料液濃度至6%，厭氧發(fā)酵30 d，測定甲烷產(chǎn)率，確定最佳的酸化時間。

1.4 響應(yīng)面最優(yōu)試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，選取酸化溫度、酸化濃度、酸化時間3個因素，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法設(shè)計試驗。試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平及編碼Table 2 Code and level for testing factors of response surface experiments

1.5 酸化處理對厭氧發(fā)酵的影響

采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化出最佳酸化處理條件，將混合原料裝入圖1的酸化裝置中進行最佳酸化條件預(yù)處理，然后在35℃條件下，置于圖2發(fā)酵裝置中厭氧發(fā)酵30 d，測定產(chǎn)氣率、甲烷總產(chǎn)量、甲烷含量和VS去除率。未酸化組直接置于圖2中的厭氧發(fā)酵瓶中進行單相厭氧發(fā)酵。以未酸化處理直接厭氧發(fā)酵的處理作對照，進行產(chǎn)氣率、甲烷總產(chǎn)量、甲烷含量和VS去除率數(shù)據(jù)的比較。

1.6 測定方法

TS和VS采用文獻[15]中的標準方法測定。餐廚垃圾和牛糞的總氮和總碳采用multi N/C 3100總有機碳/總氮分析儀（Analytik Jena公司）測定（以干質(zhì)量計），通過計算總碳與總氮的值求得C/N。將集氣袋中的氣體采用排水法測定產(chǎn)氣量，采用GA2000便攜式沼氣分析儀（Geotech公司）測定甲烷含量。

1.7 統(tǒng)計分析

采用Design Expert 7.1.3軟件的中心組合試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析模塊對重要因素的水平進行優(yōu)化，通過響應(yīng)面回歸過程（RSREG）進行數(shù)據(jù)分析，建立酸化條件對甲烷總產(chǎn)量的二次回歸模型。采用DPS 7.05軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

通過單因素方差分析（One way ANOVA，Turkey法）發(fā)現(xiàn)，攪拌頻率顯著影響了混合原料厭氧發(fā)酵的產(chǎn)甲烷率，但攪拌頻率超過2次·d-1的各處理之間無顯著差異（P＞0.05，圖3A）。攪拌頻率為3次·d-1時，產(chǎn)甲烷率達到最高值276.5 mL·g-1VS。圖3B顯示，攪拌速率對混合原料的產(chǎn)甲烷率有顯著影響，但攪拌速率超過50 r·min-1的處理之間無顯著差異（P＞0.05），產(chǎn)甲烷率穩(wěn)定在263.5～275.6 mL·g-1VS。綜合減少能耗和獲得最高甲烷產(chǎn)量的考慮，最佳的攪拌條件為3次·d-（12 min·次-1，50 r·min-1）。

圖3C顯示，酸化溫度顯著影響了混合原料的產(chǎn)甲烷率，最佳的酸化溫度為35℃，產(chǎn)甲烷率達到最高值273.8 mL·g-1VS。

從圖3D可以發(fā)現(xiàn)，酸化濃度為10%和12%時的產(chǎn)甲烷率顯著高于其他濃度處理（P＜0.05），分別為274.4 mL·g-1VS和275.9 mL·g-1VS。較高的酸化濃度可以提高原料的處理效率，因此，最佳的酸化濃度為12%。

圖3 攪拌頻率（A）、攪拌速率（B）、酸化溫度（C）、酸化濃度（D）和酸化時間（E）對甲烷產(chǎn)率的影響Figure 3 Effect of（A）stirring frequency，（B）stirring rate，（C）acidification temperature,（D）acidification concentration and（E）acidification time on methane yield of mixed materials of food waste and manure

隨著酸化時間的延長，pH先降低再升高，當(dāng)酸化時間超過一定范圍，揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）被嗜酸菌大量消耗，不利于后續(xù)產(chǎn)甲烷過程的進行。圖3E顯示，酸化時間顯著影響了混合原料的產(chǎn)甲烷率，酸化時間為8 h時，獲得最高的產(chǎn)甲烷率271.3 mL·g-1VS。

2.2 響應(yīng)面分析試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取酸化溫度（x1）、酸化濃度（x2）和酸化時間（x3）3個因素，試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

表3 酸化條件下混合發(fā)酵甲烷產(chǎn)率的中心組合試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Central composite design and results of experimental of methane production rate of anaerobic co-digestion of food waste and manure under acidification conditions

方差分析和酸化處理各因素的顯著性比較結(jié)果見表4。利用Design-Expert軟件對所得試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到以甲烷產(chǎn)率為目標函數(shù)的二次多項回歸模型：

通過方差分析（表4）可知，模型的F=792.428 3＞F0.001，P＜0.001，R2=0.999 6，表明回歸模型極顯著；失擬項P=0.130 8＞0.05，差異不顯著，說明該模型能夠反映響應(yīng)值變化，試驗誤差小，可以用此模型對產(chǎn)甲烷率進行分析和預(yù)測。模型的一次項和二次項及x2和x3交互項的影響均為極顯著。

表4 酸化處理后餐廚垃圾和牛糞混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷率的回歸方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of regression model of methane production of methane production rate of anaerobic co-digestion of food waste and manure under acidification conditions

圖4、圖5、圖6是酸化溫度、酸化濃度和酸化時間分別為35℃、12%和8 h的條件下，所得交互項的響應(yīng)面圖。可以看出，酸化溫度（x1）、酸化濃度（x2）和酸化時間（x3）3個因素與產(chǎn)甲烷率（Y）呈拋物線關(guān)系。3個響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，且在所選范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的極高值，即響應(yīng)面的最高點。

圖4 Y=f（35，x2，x3）響應(yīng)曲面圖Figure 4 Y=f（35，x2，x3）Response of factor interaction

圖5 Y=f（x1，12，x3）響應(yīng)曲面圖Figure 5 Y=f（x1，12，x3）Response of factor interaction

圖6 Y=f（x1，x2，8）響應(yīng)曲面圖Figure 6 Y=f（x1，x2，8）Response of factor interaction

圖4和圖6表明，隨著酸化濃度的增加，產(chǎn)甲烷率先升高，在酸化濃度為11%左右達到最高值，隨著酸化濃度的繼續(xù)提升，產(chǎn)甲烷率迅速下降至200 mL·g-1VS；圖4和圖5表明，隨著酸化時間的延長，產(chǎn)甲烷率也呈先升高再降低的趨勢，酸化處理8 h，厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷率最高；圖5和圖6表明，隨著酸化溫度的增加，產(chǎn)甲烷率先升高再降低，在酸化溫度為35℃左右時達到最高值。綜上所述，酸化溫度、酸化濃度和酸化時間對厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷率均呈顯著性影響。

2.3 驗證試驗

由Design-Expert 8.0軟件進行系統(tǒng)分析，預(yù)測出影響混合厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)率的最佳酸化處理條件為：酸化溫度35.80℃、酸化濃度10.42%和酸化時間7.62 h，預(yù)測值為287.60 mL·g-1VS。結(jié)合實際操作過程中的局限性，最終確定修正后的最佳酸化處理條件為：酸化溫度35.8℃、酸化濃度10.4%和酸化時間7.6 h，此時預(yù)測值為287.31 mL·g-1VS。

為了驗證模型的可靠性和準確性，在最佳酸化處理條件下進行驗證試驗，混合原料的產(chǎn)甲烷率為287.6 mL·g-1VS，預(yù)測值與試驗值的相對偏差為1.14%，小于5%，響應(yīng)面分析法可以較好地預(yù)測實際的甲烷產(chǎn)率。因此，利用響應(yīng)面分析法進行餐廚垃圾和牛糞混合厭氧發(fā)酵酸化處理條件優(yōu)化是可靠的。

2.4 酸化處理對厭氧發(fā)酵的影響

為驗證酸化處理厭氧發(fā)酵的影響，將混合原料用自來水稀釋到指定濃度后直接進行酸化，酸化過程中不添加接種物。酸化處理后，添加接種物240 mL，并用自來水調(diào)節(jié)發(fā)酵濃度至6%進行厭氧發(fā)酵。通過比較經(jīng)最佳酸化條件處理的兩相厭氧發(fā)酵及未酸化直接發(fā)酵的發(fā)酵效果，發(fā)現(xiàn)兩相厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣率、甲烷產(chǎn)率、甲烷含量和VS去除率比單相厭氧均有提高，分別提高了9.4%、17.9%、7.1%和23.6%（表5）。

表5 兩相厭氧發(fā)酵與單相厭氧發(fā)酵主要參數(shù)比較Table 5 Comparison of main parameters of anaerobic co-digestion of food waste and manure between with acidification and CK

3 討論

混合原料兩相厭氧發(fā)酵研究需要建立最佳的酸化條件和產(chǎn)甲烷條件[16-17]，水解和酸化過程是兩相厭氧工藝中的限速步驟，水解條件的優(yōu)化對提高兩相厭氧發(fā)酵效率至關(guān)重要[18]，本研究對酸化條件進行了優(yōu)化并得到了最佳的酸化條件，對產(chǎn)甲烷條件的優(yōu)化還需進一步試驗研究。

依據(jù)模型的系數(shù)估計值x1=792.4、x2=15.1和x3=1 109.7，得到影響因子的主效應(yīng)主次順序為酸化時間（x3）＞酸化溫度（x1）＞酸化濃度（x2）。

攪拌可使料液均勻分布，促進熱傳遞，利于微生物和原料的接觸，促進原料水解酸化，為產(chǎn)甲烷相提供充足的底物[19]。合適的攪拌能夠提升厭氧消化的潛力，在生產(chǎn)中攪拌頻率和攪拌速度的具體數(shù)值選擇上，還需考慮經(jīng)濟成本等多方面原因[20-22]，本試驗得出的數(shù)值可作為一個參考指標。此外，在酸化處理混合原料時，酸化裝置沒有密封，間斷性的攪拌提高了物料中的溶氧量，可能使體系中的兼性厭氧菌得到快速增長，進而加快了水解酸化的進程，對其具體影響還需進一步分析。目前主流的評價標準是以VFAs為評價指標，但在兩相厭氧發(fā)酵中的效果存在一定缺陷[23]。一般認為酸化過程中產(chǎn)生的VFAs越多，產(chǎn)甲烷量越高[13]，但是不同的VFAs組成對產(chǎn)甲烷的貢獻不同，如丙酸的累積甚至?xí)种飘a(chǎn)甲烷過程的進行[24]。因此，僅將VFAs作為考察有機物質(zhì)水解酸化效果的指標存在一定的缺陷。本試驗主要目的是為在實際生產(chǎn)中獲得更高的沼氣產(chǎn)氣量，因此，以產(chǎn)甲烷量為指標，考察了不同酸化條件對混合原料厭氧發(fā)酵的影響，確定了最佳的酸化工藝。采用本研究優(yōu)化的酸化處理條件，混合原料兩相發(fā)酵工藝的產(chǎn)氣率、產(chǎn)甲烷率、甲烷含量和VS去除率均高于未經(jīng)酸化處理的單相厭氧發(fā)酵工藝，這與劉爽[25]的研究結(jié)果基本一致。

將厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)酸相和產(chǎn)甲烷相分離，是優(yōu)化了兩者的各自功能，還是阻礙了兩者的協(xié)同關(guān)系，尚不明確。但目前越來越多的研究表明，與傳統(tǒng)的單相厭氧發(fā)酵技術(shù)相比，兩相厭氧發(fā)酵工藝在處理高濃度有機廢棄物時更具優(yōu)勢[26-27]。水解酸化過程是厭氧工藝中的限速步驟，優(yōu)化水解酸化條件對提高兩相厭氧發(fā)酵效率具有重要意義[28]。

4 結(jié)論

（1）酸化時間、酸化溫度和酸化濃度3個因素均能顯著影響甲烷產(chǎn)率，其對甲烷產(chǎn)率影響的大小為酸化時間＞酸化溫度＞酸化濃度。最佳的產(chǎn)氣條件為：濃度10.4%、溫度35.8℃、處理時間7.6 h。

（2）最佳酸化條件處理的兩相厭氧發(fā)酵與未處理單相厭氧發(fā)酵相比其產(chǎn)氣率、甲烷產(chǎn)率、甲烷含量和VS去除率分別提高了9.4%、17.9%、7.1%和23.6%。

（3）通過差異顯著性和產(chǎn)氣量分析得到最適攪拌頻率和攪拌速率分別為3次·d-1（2 min·次-1）和50 r·min-1。